JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

בניית Thioether/ויניל גופרתי-קשורה Hydrothiolation תיול-ene/yne הנוצרות על-ידי פפטידים הסליל באמצעות צילום

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

אנו מציגים את פרוטוקול לבנייה של thioether/ויניל קשורה סולפיד פפטידים הסליל באמצעות צילום-induced תיול-ene/תיול-yne hydrothiolation.

Abstract

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור הכנת פפטידים קשורה thioether תוך שימוש בשרף הבין-התפלגות מולקולרי/תיול-ene hydrothiolation. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את הכנת פפטידים ויניל-גופרתי-קשורה, שימוש בפתרון התפלגות תיול-yne hydrothiolation בין amino acids שקיימים אלקן/אלקין לצד רשתות ציסטאין שאריות-אני, אני + 4 עמדות. פפטידים ליניארי היו מסונתז באמצעות סינתזה פפטיד מוצק-פאזי סטנדרטי מבוסס Fmoc (SPPS). תיול-ene hydrothiolation מתבצעת באמצעות לתגובה thio התפלגות-ene או לתגובה thio הבין-מולקולרי-ene, בהתאם לאורך פפטיד. במחקר זה, לתגובה thio התפלגות-ene מבוצעת במקרה של פפטידים קצרים תוך שימוש בשרף deprotection של קבוצות trityl של ציסטאין שאריות לאחר הסינתזה מלאה של פפטיד ליניארי. השרף מוגדר אז הקרנת UV באמצעות photoinitiator 4-methoxyacetophenone (מפה) ו- 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). התגובה תיול הבין-מולקולרי-ene מבוצעת על ידי המסת Fmoc-Cys-OH ב הממס – dimethylformamide (DMF) N, N. זה הוא הגיבו אז פפטיד באמצעות השאריות אלקן מניבי על שרף. לאחר מכן, macrolactamization מתבצע באמצעות benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) ו- 4-Methylmorpholine (NMM) כמו ריאגנטים ההפעלה על השרף. בעקבות macrolactamization, הוא המשיך את הסינתזה פפטיד באמצעות תקן SPPS. במקרה hydrothiolation thio-yne, פפטיד ליניארי ביקע מן השרף, מיובשים, לאחר מכן מומס degassed DMF. זה ואז הוא מוקרן באמצעות אולטרא סגול עם photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). בעקבות התגובה, DMF הוא התאדה, השאריות גולמי הוא זירז וטיהרו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). שיטות אלה יכולים לפעול כדי לפשט את הדור של פפטידים מחזורית קשורה thioether עקב השימוש של הכימיה לחץ thio-ene/yne שמחזיק סובלנות קבוצה פונקציונלית מעולה ועם תשואה טובה. המבוא של אגרות חוב thioether לתוך פפטידים מנצל אופי שאריות ציסטאין נוקלאופילי, חמצון-חיזור-אינרטי ביחס חוב דיסולפידי.

Introduction

הפיתוח של ליגנדים לווסת אינטראקציות חלבון (להדברה) מספקת גישה אטרקטיבית גילוי תרופות מודרניות. לכן, כמות גדולה של מאמץ הושקעה אל תוך לימוד שיטות כימיות הרומן זה יכול לווסת ביעילות להדברה1,2,3. להדברה מורכבת בדרך כלל משטחים שמעצבת רדוד, גדולים, ו/או הופסק, מולקולות קטנות בדרך כלל נחשבים ליגנדים מתאימים עבור האפנון של להדברה4,5. מתאים חשוף שמעצבת בשטח, פפטידים קצרים לחקות תכונות מבניות של חלבון ממשקי מייצגים מועמדים אידיאליים לכתובת זו בעיה6,7. עם זאת, פפטידים קצרים הם בדרך כלל לא מובנים ב פתרון מימית. זה בשל העובדה כי מולקולות מים אשר להתחרות עם הרשת מליטה מימן התפלגות של עמוד השדרה פפטיד, מוגדרים היטב הייצורים החיים הם entropically שלילי מים8. בנוסף, של פפטידים נמוך מטבעו יציבות ואת מאפייני חדירות תא במידה רבה להגביל את השימוש בו יישומים ביולוגיים9,10. על פי ניתוח נתוני הבנק (PDB) של חלבון, > 50% להדברה לערב קצר סליל α אינטראקציות11. לכן, פותחו שיטות כימיות שונות לגבי סליל מייצב. אלה כוללים דיסולפידי/thioether בונד היווצרות12,13,14, טבעת-סגירת שיכול עיצורים15, לקטם טבעת היווצרות16, ‘לחץ’ כימיה17, תוספת של 18,perfluoroarenes19, ויניל-סולפיד היווצרות20.

פפטידים לוליינית מיוצב מנוצלים נרחב עבור מטרות תאיים שונים, כולל p53, לאסטרוגן קולטנים, ראס, BCL-2 חלבונים משפחה, ואחרים21,22,23,24. ALRN-6924,-כל-פחמימנים משודכים פפטיד מעכב כפול של MDM2, MDMX, נמצא כעת בשימוש עבור החקירה קליני25. בשנים האחרונות, הקבוצה שלנו יש התמקדו בפיתוח שיטות מייצב פפטיד הרומן באמצעות תיול-ene ו תיול-yne תגובות26,27,28. באופן כללי, אנחנו הראו תגובות אלו המופעלים באמצעות צילום יעילים בתנאים קלים כאשר באופן טבעי משמש ציסטאין בשפע. בנוסף, אנחנו הראו כי תגובות אלו של סובלנות מעולה קבוצה פונקציונלית, ביו-אורתוגונלית הינם הוכחו להיות ישימים עבור שינויים של פפטידים וחלבונים –29. פפטידים סולפיד קשורה וכתוצאה מכך thioether/ויניל בעיקר לשפר את המרחב כימי של אילוץ פפטידים, מספקים מרכז שינוי בהקשר יציב, הוכח להיות ישימים עבור שימושים רבים יישומים ביולוגיים30 ,31,32. עד כה, תוארו רק מוגבל דוחות בנוגע תיול-ene/תיול-yne פפטיד cyclization. במחקר שפורסם על-ידי. Anseth et al. ב-2009, לתגובה על-שרף התפלגות תיול-ene עבור פפטיד cyclization בין alkenes מופעל עם ציסטאין היה והפגינו33. בשנת 2015, צ’ו ואח. תיאר שני הרדיקלי יזם תיול-ene תגובה עבור פפטיד הידוק34 ו התגובה של צימוד תיול-yne/ene עוקבות, רציפים35. לאחרונה, תיאר לנו סדרה של יצירה המבוססת על thioether/ויניל סולפיד קשורה פפטידים20,26,27. פרוטוקול זה מתאר מפורטת סינתזה של פפטידים סולפיד קשורה thioether הנ ל/ויניל בתקווה שזה יהיה מועיל עבור קהילת המחקר רחבה יותר.

Protocol

1. ציוד הכנה למכשירים פפטיד ידנית-סינתזה, מקום של יריעה ואקום (טבלה של חומרים) הוד fume יעיל. בשלב הבא, המקום stopcocks משולשת על שואב האבק מניפולד ולקשר אותם אל קו גז חנקן או ארגון. שווי כל אינלטס שאינם בשימוש באמצעות septa גומי. חבר מלא שרף עמודות (0.8 x 4 ס”מ, מאגר 10-mL, ראה טבלה של ?…

Representative Results

ספקטרום HPLC ו- MS של פפטיד של Ac-YmS5AAAC-NH2 , המוצר שלה cyclized Ac – Y-(cyclo-1.5)-[mS5AAAC] – NH2 זה נוצר באמצעות את photoreaction–שרף התפלגות תיול-ene מתוארים ב איור 6B. פפטיד מחזורית נמצאה על משקל מולקולרי זהה ביחס מבשר ליניארי שלה. עם זאת, זמן השמירה שלה HPLC נצפתה לה…

Discussion

Cyclization–שרף התפלגות thio-ene המתואר באיור3, הסרת הקבוצה trityl של משקע ציסטאין נמצאו להיות צעד קריטי עבור photoreaction הבאים. בנוסף, את המשקל המולקולרי של פפטיד לפני ובעקבות שהתגובה נמצאה להיות זהה כמו מצטיירת דמות 6B. לכן, השימוש של זיהוי hplc, קורס או של DTNB assay נדרשת כדי לפק…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים לאשר תמיכה כספית נדיבה של מדעי הטבע קרן של סין המענקים (21372023 מס, 21778009, 81701818); משרד המדע והטכנולוגיה של הרפובליקה העממית של סין (מספר 2015DFA31590); שנג’ן המדע של ועדת חדשנות טכנולוגית (מס ‘ JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 ו- GJHS20170310093122365); קרן המדע פוסט-דוקטורט סין (ז 2017 מס 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Química. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Química. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

Keywords: ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
check_url/pt/57356?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image