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Química

Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

Apresentamos um protocolo para a construção de vinil/Tioéter peptídeos helicoidais sulfeto-amarrados usando foto-induzido thiol-ene/thiol-ino hydrothiolation.

Abstract

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de peptídeos Tioéter-amarrados usando hydrothiolation em resina/intramolecular intermolecular thiol-ene. Além disso, este protocolo descreve a preparação de peptídeos de vinil-sulfeto-amarrados usando na solução intramolecular thiol-ino hydrothiolation entre amino acids que possuem cadeias laterais de alceno/alquino e resíduos de cisteína na eu, i + 4 posições. Peptídeos lineares foram sintetizados usando uma síntese do peptide de fase sólida baseada em Fmoc padrão (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation é realizado usando uma reação intramolecular thio-ene ou uma reação intermolecular thio-ene, dependendo do comprimento do peptide. Nesta pesquisa, é realizada uma reação intramolecular thio-ene no caso de peptídeos menores usando na resina desproteção dos grupos trityl de resíduos de cisteína, após a completa síntese do peptide linear. A resina é então definida como irradiação UV usando fotoiniciador 4-methoxyacetophenone (mapa) e 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). A reação intermolecular thiol-ene é realizada pela dissolução de Fmoc-Cys-OH em um solvente de N, N– dimetilformamida (DMF). Isto é então reagiu com o peptídeo usando o resíduo de alceno-rolamento na resina. Depois disso, o macrolactamization é executada utilizando Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) e 4-Methylmorpholine (NMM) como reagentes de ativação na resina. Após o macrolactamization, a síntese do peptide é continuou usando padrão SPPS. No caso do thio-ino hydrothiolation, o peptídeo linear é clivado da resina, seco e posteriormente dissolvido em DMF desgaseificado. Isto então é irradiado usando luz UV com fotoiniciador 2,2-dimetoxi-2-phenylacetophenone (DMPA). Após a reação, DMF é evaporado e o resíduo bruto é precipitado e purified usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Esses métodos poderiam funcionar para simplificar a geração de péptidos cíclicos Tioéter-amarrados devido ao uso da química clique thio-ene/ino que possui tolerância superior grupo funcional e bom rendimento. A introdução de títulos Tioéter peptídeos aproveita-se da natureza nucleofílica de resíduos de cisteína e redox-inerte em relação a ligações de bissulfeto.

Introduction

O desenvolvimento de ligantes para modular interações da proteína-proteína (PPIs) fornece uma abordagem atraente para descoberta de drogas modernas. Assim, uma grande quantidade de esforço tem sido investida em estudar modalidades chemical romance que podem eficientemente modular PPIs1,2,3. IPP consiste geralmente em superfícies de interação superficiais, grandes e/ou descontinuadas, e pequenas moléculas são normalmente consideradas ligantes impróprios para a modulação de PPIs4,5. Com uma adequada expostas interação superfície, peptides curtos que imitam as características estruturais das interfaces de proteína representam candidatos ideais para abordar este problema6,7. No entanto, peptides curtos são tipicamente não-estruturados em uma solução aquosa. Isto é devido ao fato de que as moléculas de água que competem com a rede de ligação de hidrogênio intramolecular da espinha dorsal do peptide e conformações bem-definidos são entropically desfavoráveis em água8. Além disso, os peptídeos inerentemente baixa estabilidade e propriedades de permeabilidade da célula, em grande parte, limitar seu uso em aplicações biológicas9,10. De acordo com a análise de banco de dados (PDB) de proteína, > 50% de IPP envolvem interações de α-hélice curta11. Assim, foram desenvolvidos métodos químicos diferentes em relação à estabilização da hélice. Estes incluem bissulfeto/Tioéter vínculo formação12,13,14, anel-fechamento metátese15, lactam anel formação16, “clique em” química17, adição de perfluoroarenes18,19e vinil-sulfureto formação20.

Peptídeos helicoidais estabilizados são amplamente utilizados para vários alvos intracelulares, incluindo p53, família proteínas do estrogênio receptores, Ras, BCL-2 e outros21,22,23,24. ALRN-6924, um hidrocarboneto-tudo grampeado inibidor duplo de peptídeo de MDM2 e MDMX, atualmente está sendo usado para investigações clínicas25. Nos últimos anos, nosso grupo tem focado o desenvolvimento de métodos de estabilização de peptídeo romance usando thiol-Eno e ino-tiol reações26,,27,28. Em geral, temos demonstrado que estas reações foto-iniciada são eficientes em condições suaves quando naturalmente abundante cisteína é usada. Além disso, mostramos que essas reações têm uma tolerância de excelente grupo funcional, são ortogonais-bio e tem sido provadas para ser aplicável para modificações de peptídeos e proteínas29. Os peptídeos de sulfeto amarrado Tioéter/vinil resultante em grande parte melhorar o espaço químico de peptídeos de restrição, fornecem um centro lábil em-baraço de modificação e provou para ser aplicável para usos em numerosas aplicações biológicas30 ,31,32. Até à data, apenas limitados relatórios têm sido descritos em relação a ciclização de peptídeo thiol-ene/thiol-ino. Em um estudo publicado por Anseth et al , em 2009, uma reação na resina intramolecular thiol-ene para ciclização de peptídeo entre alquenos ativados com cisteína foi demonstrada33. Em 2015, Chou et al. descreveu uma reação de dois componentes radicais tiol iniciados-ene para peptídeo grampeamento34 e uma reação de acoplamento de thiol-ino/ene subsequentes, sequencial35. Recentemente, nós descrevemos uma série de trabalhos baseados em vinil/Tioéter sulfeto amarrado peptídeos20,26,27. Este protocolo descreve uma síntese detalhada dos peptides sulfeto amarrado acima mencionados Tioéter/vinil na esperança que será útil para a comunidade de pesquisa mais ampla.

Protocol

1. preparação do material Para o aparelho manual do peptide-síntese, coloca um distribuidor de vácuo (Tabela de materiais) em uma coifa eficiente. Em seguida, colocar torneiras de três vias para o distribuidor de vácuo e conectá-los a uma linha de gás nitrogênio ou argônio. Cap todas as entradas não utilizadas, usando os septos de borracha. Ligar colunas cheias de resina (0,8 x 4 cm, 10 mL de reservatório, consulte Tabela de materiais) para o distribuidor …

Representative Results

Os espectros HPLC e MS do peptide Ac-Aderson5AAAC-NH2 e seu produto ciclizada Ac – Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] – NH2 que foram gerados usando o é em resina intramolecular thiol-ene são retratados em Figura 6B. O peptídeo cíclico foi encontrado para ter um peso molecular idêntico em relação ao seu precursor linear. No entanto, observou-se seu tempo de retenção HPLC para ser aproximadamente 2 min mais cedo do que…

Discussion

Na ciclização em resina intramolecular thio-ene descrita na Figura 3, a remoção do grupo trityl de um resíduo de cisteína foi encontrada para ser um passo fundamental para a posterior é. Além disso, o peso molecular de peptídeo antes e seguintes, que a reação foi encontrada para ser idênticos como representado na Figura 6B. Portanto, o uso de uma identificação de HPLC ou um ensaio DTNB é necessário para monitorar a reação. No caso da reação i…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem apoio financeiro por parte da ciência Natural da China subsídios da Fundação (n. º 21372023, 21778009 e 81701818); o Ministério da ciência e tecnologia da República Popular da China (n. º 2015DFA31590); a ciência de Shenzhen e tecnologia inovação Comitê (n. º JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 e GJHS20170310093122365); e a Fundação de ciência Postdoctoral China (n. º 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
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Referências

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Keywords: ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
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Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
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