الكشف عن حساسية عالية من ميكروميتاستاسيس المتولدة عن التجارة والنقل ترانسدوسيد لينتيفيروس أورجانويدس مثقف من ورم القولون المستمدة من المريض
Summary
للسماح للكشف عن درجة عالية من الحساسية لسرطان القولون والمستقيم البشرية نشر الخلايا (CRC) استعمار الأنسجة، نعرض هنا بروتوكولا لكفاءة توصيل الجسيمات لينتيفيرال البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) إلى خلايا أورجانويد المستمدة من PDX CRC قبل الحقن في الفئران المستفيدة، مع ملاحظة مجهرية ستيريو-الأسفار.
Abstract
وعلى الرغم من التقدم الحالي في علاج سرطان القولون والمستقيم البشرية (CRC)، علاجات جذرية قليل فعالة للمراحل المتأخرة من اتفاقية حقوق الطفل. للتغلب على هذا التحدي السريرية، والورم إكسينوجرافت الماوس نماذج استخدام الراسخة قد وضعت خطوط الخلايا البشرية سرطان والعديد من نماذج الماوس المحورة وراثيا بالأورام كنماذج الإكلينيكية. جزئيا تحاكي ملامح السرطانات البشرية، ولكنها غالباً ما تفشل بإيجاز الجوانب الرئيسية للأورام الخبيثة البشرية بما في ذلك الغزو، وورم خبيث. وهكذا، طال انتظار النماذج البديلة التي تمثل أفضل تطور خبيث في البشرية اتفاقية حقوق الطفل.
هنا نعرض جيل تكثيفها الورم المستمدة من المريض (بدكسس) بغرس تحت الجلد الصغيرة الشظايا CRC تشريح جراحيا من مريض. القولون بدكسس تطوير ويشابه هيستوباثولوجيكالي اتفاقية حقوق الطفل في المريض. ومع ذلك، ميكروميتاستاسيس عفوية قليلة قابلة للاكتشاف في المقاطع العرضية التقليدية المتأثرة الأجهزة البعيدة في نموذج PDX. لتيسير الكشف عن نشر المنتشر في الأجهزة البعيدة، استخرجنا الخلايا السرطانية أورجانويد من بدكسس القولون في الثقافة والمصابين منهم lentivirus التجارة والنقل قبل الحقن في شدة العوز إيماءة/شي-إخضاعها IL2Rγفارغة (null) الفئران (وتد). الخلايا أورثوتوبيكالي حقن CRC المستمدة من PDX أورجانويد دائماً شكل الأورام الأولية الإيجابية للتجارة والنقل في الفئران المستفيدة. وعلاوة على ذلك، وضع عفويا ميكروميتاستاتيك المستعمرات معربا عن التجارة والنقل لا سيما اكتشاف في الرئتين من هذه الفئران بالفحص المجهري الأسفار. وعلاوة على ذلك، حقن إينتراسبلينيك من أورجانويدس لجنة حقوق الطفل كثيرا ما تنتج الاستعمار الكبد. أخذت معا، تشير هذه النتائج إلى المسمى بروتينات فلورية خضراء في الخلايا أورجانويد PDX المستمدة من اتفاقية حقوق الطفل أن يكون بصريا يمكن اكتشافها أثناء عملية متعددة الخطوات ووصف تتالي غزو خبيث. وتشمل البروتوكولات وصف إنشاء بدكسس البشرية اتفاقية حقوق الطفل، وثقافة 3D من الخلايا أورجانويد CRC المقابلة ترانسدوسيد بجسيمات لينتيفيرال التجارة والنقل.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي الثاني لوفيات السرطان في جميع أنحاء العالم1. عدم كفاية الاستجابة للعلاجات التقليدية للمرضى الذين يعانون من المرض مرحلة متقدمة تشير إلى عدم فعالية المحاولات الرامية إلى علاج جذري المجتمعي. وضع نهج علاجية أكثر فعالية، تم إنشاء مختلف نماذج الماوس الإكلينيكية للسرطان التي تحاكي خصائص مراكز التأهيل المجتمعي. مختلف خطوط الخلايا في اتفاقية حقوق الطفل قد استخدمت على نطاق واسع لتوليد تكثيفها الورم سبب راحة وسهولة التلاعب. ثقافة طويلة الأجل لخطوط خلايا السرطان، ومع ذلك، غالباً ما يسبب اختيار السكان الخلايا الفريدة التي التكاثري تماما تحت شرط ثقافة معينة، مما يؤدي إلى نتائج لا يمكن الاعتماد عليها والقيود الحاسمة في العقاقير السريرية التنمية.
دون أن يكون مثقف في المختبر، كما تم إنشاؤها تكثيفها الورم المستمدة من المريض (بدكسس) بواسطة غرس في نماذج حيوانية للأنسجة البشرية CRC تشريح جراحيا من المرضى2،،من34. بدكسس معروفة على نطاق واسع كما لخص أهم الميزات التشريحية المرضية والتعديلات الوراثية الموجودة أصلاً في أورام المرضى التي اشتقت منها. وعلاوة على ذلك، أورجانويدس الورم المستمدة من المريض تتألف من خلية الورم ووضعت مجموعات الثقافة ظروف 3D الذي يحاكي عن كثب الخصائص البيولوجية للأورام الأصلي5،6. وطبقت هذه أورجانويدس الورم أيضا لفحص المخدرات الفائق، مما يسمح للعلاجات مخصصة لتكون مصممة5. بيد غير متجانسة على نحو ملحوظ CRC السكان يفترض أن تكون موجودة داخل ورم الجماهيري. قد بشكل انتقائي تتكاثر خاصة CRC السكان وتوسيع خلال السلسلة في الجسم الحي وفي المختبر من الممرات PDX والورم أورجانويدس، على التوالي. قد يسمح هذا أيضا ملامح التعبير الجيني الشاملة وبرنامج التحصين الموسع والوراثية مركز من مراكز التأهيل المجتمعي المتأثرة تغيير، مما يؤدي إلى تشابه الحد الأدنى لاتفاقية حقوق الطفل الوالدية.
أورجانويدس CRC المستمدة من المريض وتلك المستخرجة من القولون البشرية نونكانكيرووس إجراء هندسة عكسية للميناء مجموعات من الطفرات النمطان استخدمت أيضا للتحقيق في السمات المميزة للخلايا السرطانية البشرية المتمثلة بغزو الورم وورم خبيث 67،،،من89. ومع ذلك، حدوث منخفضة جداً من ورم خبيث العفوية الناشئة عن أورثوتوبيك غرس CRC المستمدة من المريض في الفئران العوز، جعلت من الصعب لدراسة عملية متعددة الخطوات لتتالي غزو خبيث يحتوي على المحلية الغزو، إينترافاسيشن، النقل في مجرى الدم، والتسرب واستعمارها للأجهزة البعيدة4،10. ميكروميتاستاسيس كممثلة بورم الخلايا ترسب مم دي تو، شكلتها المستمدة من المريض أورجانويدس اتفاقية حقوق الطفل، وغالباً ما تم تجاهله في تحليل نسيجية للأقسام من الأجهزة البعيدة المتضررة في النماذج التجريبية الماوس. التصور ميكروميتاستاسيس عفوية وقد الحد الأدنى في فيفو نظراً لصعوبة كفاءة إدخال علامات مضيئة في الخلايا السرطانية أورجانويد قبل الحقن في الفئران المستفيدة. في هذه الدراسة، وضعنا بروتوكولا كفاءة ترانسدوسي lentivirus التجارة والنقل إلى الخلايا أورجانويد المستمدة من PDX CRC في الثقافة 3D قبل الحقن في الفئران المستفيدة والسماح للكشف عن درجة عالية من الحساسية، استخدام الفحص المجهري ستيريو-الأسفار، لما استعمار أجهزة مختلفة للنموذج ميكروميتاستاسيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن نموذج PDX اتفاقية حقوق الطفل قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة نمو الورم الرئيسي، ما إذا كان هذا النموذج ينطبق أيضا على التحقيق في ورم خبيث قد لا بعد تم تماما توضيحها. وكانت أيضا الانبثاث العفوية بالكاد يمكن كشفها في الكبد والرئتين من مختلف عن القولون PDX نماذج4،</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل وأيده “جونتيندو جامعة يونغ محقق الجائزة” (2013 و 2014 و 2015) يو، و “منح المشروع المشترك” (2013 و 2014) إلى ك. م.، ومنح المعونة “البحث العلمي” من وزارة التربية والتعليم والثقافة، والرياضة والعلوم و التكنولوجيا، اليابان (16 15625 ك إلى ك. ي. و 16 ك 15598 للشخص). ونحن ممتنون خاصة لجميع أعضاء قسم الجراحة كولوبروكتولوجيكال و “علم الأمراض الجزيئية” للمناقشات المفيدة والدعم التقني. كما نشكر الدكتور هيرويوكي كونو (جامعة هاماماتسو شولوف الطب) والدكتور هيديكي كيتاجيما (الجامعة الدولية للصحة والرعاية الاجتماعية) على التوجيه التقني السخي في الإجراءات الجراحية لزرع أورثوتوبيك في الفئران والدكتور. يوشيتاكا فرس النهر (مركز شيبا للسرطان) للمشورة التقنية بشأن أداء الثقافة أورجانويد الورم.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
Referências
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O’Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
