Rilevamento ad alta sensibilità dei Micrometastases generati da GFP trasdotte Lentivirus Organoids coltivate da un tumore del Colon paziente-derivato
Summary
Per consentire la rivelazione altamente sensibile del cancro colorettale umano diffondere cellule (CRC), colonizzando tessuti, mostriamo qui un protocollo per la trasduzione efficiente delle particelle lentivirali proteina fluorescente verde (GFP) in cellule di organoid PDX-derivato CRC prima del loro iniezione nel destinatari topi, con osservazione al microscopio stereo-fluorescenza.
Abstract
Malgrado gli avanzamenti correnti nel trattamento del cancro umano del colon-retto (CRC), poche terapie radicali sono efficaci per la fine delle fasi di CRC. Per superare questa sfida clinica, modelli murini dello xenotrapianto di tumore utilizzando consolidate linee cellulari umane di carcinoma e molti modelli di topi transgenici con i tumori sono stati sviluppati come modelli preclinici. Essi parzialmente imitare le caratteristiche di carcinoma umani, ma spesso non riescono a riassumere gli aspetti principali delle malignità umane, compreso l’invasione e metastasi. Così, modelli alternativi che meglio rappresentano la progressione maligna in CRC umana hanno lungamente attesa.
Per l’impianto sottocutaneo di piccoli frammenti CRC sezionato chirurgicamente da un paziente mostreremo qui generazione degli xenotrapianti del tumore di derivazione paziente (PDXs). Il colon PDXs sviluppare e histopathologically assomigliano il CRC nel paziente. Tuttavia, pochi i micrometastases spontanei sono rilevabili in sezioni convenzionali degli organi commoventi distanti nel modello PDX. Per facilitare l’individuazione di disseminazione metastatica in organi distanti, abbiamo estratto le cellule del tumore organoid dalla PDXs del colon nella cultura e li infettato da lentivirus GFP prima dell’iniezione in altamente immunodeficienti Shi-NOD/scid IL2Rγnull Topi (NOG). Orthotopically iniettato PDX-derivato CRC organoid cellule costantemente forma tumori primari positiva per GFP in topi destinatari. Inoltre, spontaneamente sviluppando micrometastatico colonie che esprimono GFP in particolare vengono rilevati nei polmoni di questi topi mediante microscopia a fluorescenza. Inoltre, intrasplenic iniezione di CRC organoids produce frequentemente colonizzazione epatica. Presi insieme, questi risultati indicano GFP-etichettato di cellule CRC PDX-derivato organoid essere visivamente rilevabili durante un processo a più stadi definito la cascata di invasione-metastasi. I protocolli descritti includono l’istituzione di PDXs di CRC umana e cultura 3D delle corrispondenti cellule CRC organoid microlavorata in particelle lentivirali GFP.
Introduction
Il cancro colorettale (CRC) è la seconda causa principale di morti di cancro in tutto il mondo1. La risposta insufficiente a terapie convenzionali dei pazienti con malattia in stadio avanzato indica l’inefficacia dei tentativi di curare radicalmente CRCs. Per sviluppare approcci terapeutici più efficaci, sono stati istituiti vari modelli del mouse preclinici di cancro che imitano le caratteristiche del CRC. Varie linee cellulari CRC sono stati ampiamente usati per generare gli xenotrapianti del tumore a causa della loro convenienza e facilità di manipolazione. Coltura a lungo termine di linee cellulari del cancro, tuttavia, è spesso causa di selezione di popolazioni di cellule uniche che sono abbastanza proliferativa in una condizione di determinate impostazioni cultura, quindi con conseguente risultati inaffidabili e limitazioni cruciale nella droga preclinico sviluppo.
Senza essere coltivate in vitro, xenotrapianti paziente-derivato del tumore (PDXs) inoltre sono stati generati tramite impianto in modelli animali di tessuti umani CRC chirurgicamente dissecati da pazienti2,3,4. PDXs sono ampiamente riconosciuti come ricapitolare le principali caratteristiche istopatologiche e alterazioni genetiche originariamente presentano nei tumori dei pazienti da cui sono stati derivati. Inoltre, tumore di derivazione paziente organoids composta di cellula tumorale, i cluster sono stati stabiliti dalla cultura in condizioni 3D che imitato molto attentamente le proprietà biologiche dei tumori originale5,6. Questi organoids del tumore sono state applicate anche per lo screening di stupefacenti ad alta produttività, consentendo in tal modo terapie personalizzate essere progettato5. Tuttavia, popolazioni di CRC marcatamente eterogenee sono presupposti per essere presenti all’interno di un tumore massa. Popolazioni particolari di CRC potrebbero selettivamente proliferare ed espandersi durante della serie in vivo e in vitro dei passaggi dei organoids PDX e tumore, rispettivamente. Ciò potrebbe consentire anche i profili di espressione genica globale e status epi/genetico del CRCs interessato al cambiamento, quindi con conseguente minima somiglianza con il CRC dei genitori.
Paziente-derivati organoids CRC e quelli estratti da noncancerous colon umano progettato per harbor combinazioni di mutazioni oncogeniche sono state impiegate anche per indagare le caratteristiche delle cellule umane del tumore esemplificate da invasione del tumore e metastasi 6,7,8,9. Tuttavia, la bassissima incidenza di metastasi spontanea derivanti dall’impianto di orthotopic del paziente-derivato CRC in topi immunodeficienti, ha reso difficile studiare il processo multifasico della cascata invasione-metastasi che include locali invasione, intravasation, trasporto nella circolazione sanguigna, lo stravaso e colonizzazione di organi distanti4,10. Micrometastasi come rappresentato dalla deposizione delle cellule del tumore di ≤ 2 mm, formano da paziente-derivati organoids CRC, sono stato spesso trascurato su analisi istopatologica delle sezioni da organi colpiti distanti in modelli sperimentali murini. Visualizzazione dei micrometastases spontaneo è stato anche minima in vivo a causa della difficoltà di introdurre in modo efficiente marcatori fluorescenti nelle cellule organoid del tumore prima del loro iniezione nel destinatari topi. In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo efficiente trasduce lentivirus GFP nelle cellule di organoid CRC PDX-derivato in 3D cultura prima dell’iniezione in topi destinatari e per consentire di rivelazione altamente sensibile, che impiegano microscopia stereo-fluorescenza, della loro colonizzazione di diversi organi a forma i micrometastases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se il modello di CRC PDX è stato ampiamente impiegato per studiare la crescita del tumore primario, se questo modello è applicabile anche ad indagare la metastasi del tumore non è ancora stato completamente delucidato. Le metastasi spontanee erano anche a mala pena rilevabile nel fegato e polmoni di vari segnalati del colon PDX modelli4,10. Per rilevare i micrometastases con alta sensibilità, abbiamo sviluppato un protocollo per trasdurre particelle len…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 e 2015) per anni, il Joint Project Award (2013 e 2014) a K. M. e concede in aiuti per la ricerca scientifica dal Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e Tecnologia, Giappone (16K 15625 a K. Y. e 16K 15598 al Mahatma Gandhi). Siamo particolarmente grati a tutti i membri del dipartimento di chirurgia Coloproctological e patologia molecolare per utili discussioni e supporto tecnico. Ringraziamo anche Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University Schoolof Medicine) e Dr. Hideki Kitajima (Università internazionale di salute e benessere) per indicazioni tecniche generosa nelle procedure chirurgiche per l’impianto di orthotopic in topi e Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) per consigli tecnici su come eseguire la cultura di tumore organoid.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
Referências
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