Deteção de alta sensibilidade de Micrometastases gerado pelo Organoids GFP de Lentivirus-transfectadas cultivadas de um Tumor de cólon derivado de paciente
Summary
Para permitir a detecção altamente sensível do câncer colorretal humano divulgação células (CRC) colonizar os tecidos, mostramos aqui um protocolo para transdução eficiente de particulas de Lentivirus de proteína verde fluorescente (GFP) em células de organoides CRC PDX-derivado antes da sua injeção em ratos destinatários, com a observação microscópica de estéreo-fluorescência.
Abstract
Apesar dos avanços atuais no tratamento do câncer colorretal humano (CRC), poucas terapias radicais são eficazes para as fases finais da CRC. Para superar este desafio clínico, modelos de rato de enxerto heterólogo tumor usando linhas de células de carcinoma humano há muito estabelecidos e muitas mouse transgênicos foram desenvolvidos modelos com tumores como modelos pré-clínicos. Eles imitam parcialmente as características de carcinomas humanos, mas muitas vezes não conseguem recapitular os principais aspectos da malignidade humana, incluindo a invasão e metástase. Assim, modelos alternativos que melhor representam a progressão maligna no CRC humana há muito aguardados.
Aqui mostramos geração de xenografts tumor derivado de paciente (PDXs) implantação subcutânea de pequenos fragmentos CRC cirurgicamente dissecado de um paciente. O cólon PDXs desenvolver e histopatologicamente assemelham-se a CRC no paciente. No entanto, alguns micrometastases espontâneas são detectáveis em secções transversais convencionais de afetados órgãos distantes no modelo PDX. Para facilitar a detecção de disseminação metastática para órgãos distantes, nós extraídas as células do tumor organoides os cólon PDXs na cultura e eles infectados com lentivirus GFP antes da injeção no altamente imunodeficientes Shi-NOD/scid IL2Rγnulo Ratos (NOG). Orthotopically injetado PDX-derivado CRC organoides células consistentemente positivo de tumores primários de forma de GFP em ratos do destinatários. Além disso, a desenvolver espontaneamente micrometastatic colônias expressando GFP notavelmente são detectadas nos pulmões destes ratos por microscopia de fluorescência. Além disso, intrasplenic injeção de CRC organoids frequentemente produz colonização hepática. Tomados em conjunto, estas descobertas indicam GFP-rotulados células de organoides CRC PDX-derivado para ser visualmente detectável durante um processo de várias etapas denominadas cascata de invasão-metástase. Os protocolos descritos incluem o estabelecimento de PDXs de CRC humana e cultura 3D das correspondentes CRC organoides células transfectadas por particulas de Lentivirus de GFP.
Introduction
Câncer colorretal (CRC) é a segunda causa principal de mortes de câncer em todo o mundo1. A resposta insuficiente a terapias convencionais de pacientes com estágio avançado da doença indica a ineficácia das tentativas de curar radicalmente CRCs. Para desenvolver abordagens terapêuticas mais eficazes, se estabeleceram vários modelos pré-clínicos rato de câncer que imitam as características dos CRCs. Várias linhas de célula CRC foram amplamente utilizadas para gerar xenografts tumor devido a sua comodidade e facilidade de manipulação. Cultura a longo prazo de linhas de células de câncer, no entanto, muitas vezes provoca a seleção de populações de células únicas que são bastante proliferativa sob uma condição de determinada cultura, assim, resultando em resultados não-confiáveis e limitações cruciais em drogas pré-clínicos desenvolvimento.
Sem ser cultivadas em vitro, xenografts tumor derivado de paciente (PDXs) também foram gerados pela implantação em modelos animais de tecidos humanos do CRC cirurgicamente dissecados de pacientes2,3,4. PDXs são amplamente reconhecidos como sintetizando as principais características histopatológicas e alterações genéticas originalmente presente em tumores de pacientes de que elas derivam. Além disso, organoids derivado de paciente tumor composto de células de tumor aglomerados foram estabelecidos pela cultura sob condições 3D que imitam pròxima as propriedades biológicas dos tumores original5,6. Estes organoids do tumor também foram aplicadas para triagem de drogas de alta produtividade, permitindo assim terapias personalizadas para ser projetado5. No entanto, marcadamente heterogêneas populações CRC são assumidas como para estar presente dentro de um tumor em massa. Populações particulares CRC seletivamente podem proliferar e expandir durante a série in vivo e in vitro de passagens de PDX e tumor organoids, respectivamente. Isso pode também permitir que os perfis de expressão de gene global e epi/genética status dos CRCs afetados para mudar, assim resultando em mínima semelhança com a CRC parental.
Paciente-derivado organoids CRC e aqueles extraídos do cólon humano não cancerosos, projetado para o porto de combinações de mutações oncogênicas também têm sido empregadas para investigar as principais características das células de tumor humano exemplificadas pela invasão do tumor e metástases 6,7,8,9. No entanto, a incidência muito baixa de metástases espontâneas decorrentes da implantação ortotópico de paciente-derivado CRC em camundongos imunodeficientes, tornou difícil estudar o processo de várias etapas da cascata invasão-metástase que inclui locais invasão, intravasation, transporte na corrente sanguínea, extravasamento e colonização de órgãos distantes4,10. Micrometastasis como representado pela deposição de células de tumor de ≤ 2 mm, formado por paciente-derivado CRC organoids, tem sido negligenciado frequentemente na análise histopatológica de seções de órgãos distantes afetados em modelos experimentais de rato. Visualização das micrometastases espontânea também foi mínimo na vivo devido à dificuldade de introduzir eficientemente marcadores fluorescentes em células tumorais de organoides antes da sua injeção no destinatários ratos. Neste estudo, nós desenvolvemos um protocolo eficiente transduce lentivirus GFP em células de organoides PDX-derivado CRC na cultura 3D antes da injeção em ratos destinatários e para permitir a detecção altamente sensível, empregando microscopia de fluorescência-estéreo, de sua colonização de órgãos diferentes para a forma micrometastases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora o modelo CRC PDX tem sido amplamente utilizado para estudar o crescimento do tumor primário, se este modelo também é aplicável para investigar a metástase do tumor ainda não foi totalmente elucidado. Metástases espontâneas também foram mal detectáveis no fígado e pulmões de vários comunicados cólon PDX de modelos de4,10. Para detectar micrometastases com alta sensibilidade, desenvolvemos um protocolo para transducing particulas de Lentivirus …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 e 2015) a Yo, o prêmio de projeto conjunto (2013 e 2014) para K. M. e concede em auxílio para a investigação científica do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e Tecnologia, Japão (16 15625 K a K. Y. e 16K 15598 para M.G.). Somos especialmente gratos a todos os membros do Dept. de Coloproctological cirurgia e Patologia Molecular para discussões úteis e suporte técnico. Agradecemos também Dr. Hiroyuki Konno (Universidade de Hamamatsu escola medicina) e Dr. Hideki Kitajima (Universidade Internacional da saúde e bem-estar) pela generosa orientação técnica nos procedimentos cirúrgicos para implantação ortotópico em ratos e Dr. Yoshitaka hipopótamo (Chiba Cancer Center) para aconselhamento técnico sobre como realizar a cultura de organoides do tumor.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
Referências
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