Ultralow Input genoom Sequencing bibliotheek bereiding op basis van een enkel exemplaar van de Tardigrade
Summary
Besmetting tijdens de genomic sequencing van microscopische organismen blijft een groot probleem. Hier, laten we een methode om het genoom van een beerdiertjes uit een enkel exemplaar met zo weinig als 50 pg van genomic DNA zonder het hele genoom versterking om te minimaliseren van het risico van besmetting.
Abstract
Beerdiertjes zijn microscopisch kleine dieren die worden ingevoerd door de staat van een ametabolic genaamd anhydrobiosis wanneer geconfronteerd met uitdroging en kan hun oorspronkelijke staat te herstellen wanneer water wordt aangevoerd. Het genoom sequentiebepaling van microscopisch kleine dieren zoals beerdiertjes risico’s bacteriële besmetting dat soms tot verkeerde interpretaties, bijvoorbeeld met betrekking tot de omvang van horizontale genoverdracht in deze dieren leidt. Hier bieden we een ultralow input-methode om het genoom van de beerdiertjes, Hypsibius dujardini, van een enkel exemplaar. Door gebruik te maken van strenge wassen en verontreinigingen uitsluiting samen met een efficiënte winning van de 50 ~ 200 pg genomic DNA van een enkel individu, we gebouwd een bibliotheek sequenced met een DNA-sequencing-instrument. Deze bibliotheken waren zeer reproduceerbaar en onbevooroordeelde, en een analyse van de informatica van de gesequenceerd luidt met andere H. dujardini -genoom toonden een minimale hoeveelheid verontreiniging. Deze methode kan worden toegepast op unculturable beerdiertjes die niet kon worden sequenced met behulp van de vorige methoden.
Introduction
Beerdiertjes zijn microscopisch kleine dieren die een ametabolic staat genoemd anhydrobiosis wanneer geconfronteerd met uitdroging kunnen worden ingevoerd. Zij herstellen door de absorptie van water1,2. In de ametabolic staat kunnen beerdiertjes gedogen van verschillende extreme omgevingen, waaronder extreme temperaturen3 en druk4,5, een hoge dosering van ultraviolet licht6, x-stralen en gammastralen 7 , 8pt9van de kosmische ruimte. Genomic gegevens is een onmisbaar fundament voor de studie van moleculaire mechanismen van anhydrobiosis.
Eerdere pogingen om het genoom van beerdiertjes is gebleken tekenen van bacteriële besmetting10,11,12,13,14. Genoom sequentiebepaling van dergelijke kleine organismen vereist een groot aantal dieren en is gevoelig voor bacteriële besmetting; Daarom hebben we een protocol van de sequencing met behulp van een ultralow invoermethode vanaf een enkel exemplaar van beerdiertjes, tot een minimum beperken van het risico van verontreinigingen15eerder opgericht. Met behulp van deze gegevens, hebben we verder uitgevoerd een kwalitatief hoogwaardige manipulatie en de opbouw van het genoom van H. dujardini16,17. Hier beschrijven we in detail deze methode voor het genomic rangschikken van een individu tardigrade ()Figuur 1). De validatie van deze methode sequencing is voorbij de focus van dit papier en is reeds grondig besproken in ons vorige verslag16.
Deze methode bestaat uit twee delen: de isolatie van een enkele beerdiertjes met de laagst mogelijke verontreiniging en de kwalitatief hoogwaardige extractie van pictogram niveaus van DNA. De beerdiertjes is uitgehongerd en grondig gespoeld met water, evenals antibiotica en waargenomen onder een microscoop met vergroting van 500 X om het verwijderen van eventuele bacteriële besmetting. Eerdere schattingen en metingen tonen aan dat een enkel individu van beerdiertjes ongeveer 50-200 pg genomic DNA16, die is geëxtraheerd bevat door het kraken van chitine exoskeleton door cycli bevriezen-ontdooien of door handmatige homogenisering. Deze genomic DNA is voorgelegd aan de bouw van de bibliotheek en sequenced op een DNA-sequencing-instrument. Een extra informatica-analyse toont kwalitatief hoogwaardige sequencing, evenals lage niveaus van verontreiniging in vergelijking met eerdere tardigrade sequencing projecten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacteriële besmetting vormt een bedreiging voor het genoom sequentiebepaling van microscopisch kleine organismen. Hoewel eerdere studies op tardigrade genoom sequencing hebt gefilterd uit besmetting met behulp van uitgebreide informatica methoden12,20, sequenced we het genoom van een individu om te minimaliseren van het risico van verontreinigingen. Aangezien een individuele beerdiertjes bevat ongeveer 50-200 pg genomic DNA16 en is ingeka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Nozomi Abe, Yuki Takai en Nahoko Ishii voor hun technische ondersteuning in genomic sequencing. Dit werk werd gesteund door de Grant-in-Aid voor de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) Research Fellow, KAKENHI Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (No.22681029) en KAKENHI Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (B), No. 17 H 03620 van de JSPS, door een Subsidie voor elementaire wetenschap-onderzoeksprojecten uit The Sumitomo Foundation (No.140340), en deels door de middelen voor onderzoek van de departementale overheid Yamagata en Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris gebruikt om te voeden de beerdiertjes was voorzien hoffelijkheid van Chlorella Industry Co. LTD.
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
Referências
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
