Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama
Summary
Mikroskobik organizmaların genomik sıralama sırasında kontaminasyon büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. İşte, bir tardigrade tek bir örnekten genom genomik DNA tüm genom amplifikasyon olmadan bulaşma riskini en aza indirmek için olduğu kadar az 50 pg ile sıralamak için bir yöntemi göstermektedir.
Abstract
Tardigrades su verildiğinde kuruma ve -ebilmek karşısında zaman denilen anhydrobiosis özgün durumlarına geri dönmek bir ametabolic durumuna girmek mikroskobik hayvanlardır. Genomik nasıl yapılacağını mikroskobik hayvan gibi tardigrades riskleri bakteriyel kontaminasyon bazen hatalı yorumlara, örneğin, yatay gen transferi bu hayvanlarda ölçüde ilgili yol açar. Burada, tardigrade, Hypsibius dujardini, tek bir örnekten genom sıralamak için bir ultralow giriş yöntemi sağlamak. Titiz çamaşır ve kirletici dışlama 50 verimli bir ayıklama birlikte istihdam tarafından ~ 200 pg genomik DNA’sı tek bir kişi, bir DNA sıralama aletle sıralı bir kütüphane inşa. Bu kütüphanelerin son derece tekrarlanabilir ve tarafsız ve sıralı okuma diğer H. dujardini genleri ile Bilişim Analizi kirlenme az miktarda gösterdi. Bu yöntem önceki yöntemleri kullanarak sıralı değil unculturable tardigrades için uygulanabilir.
Introduction
Tardigrades bir ametabolic devlet anhydrobiosis kuruma karşısında zaman denir girebilirsiniz mikroskobik hayvanlardır. Onlar su1,2absorpsiyonu ile yeniden elde etmek. Ametabolic durumda tardigrades aşırı sıcaklıklar3 ve baskıların4,5, ultraviyole ışık6, x ışını ve gama ışınları yüksek bir doz içeren çeşitli en uçtaki çevre, tolere yeteneğine 7 , 8ve kozmik uzay9. Genomik veri anhydrobiosis moleküler mekanizmaları çalışmanın vazgeçilmez bir temelidir.
Tardigrades genom sıralamak için önceki girişimleri bakteriyel kontaminasyon10,11,12,13,14belirtileri göstermiştir. Genomik sıralama böyle küçük organizmalar gelen çok sayıda hayvan gerektirir ve bakteriyel kontaminasyon için eğilimli; Bu nedenle, daha önce bir ultralow giriş yöntemi tardigrade, tek bir örnek başlayan contaminations15riskini en aza indirmek için bir sıralama iletişim kuralı’nı kurduk. Bu verileri kullanarak, biz daha fazla bir yüksek kaliteli içinden ve genom H. dujardini16,17yeniden montajı yaptık. Burada biz bu yöntem tek bir tardigrade kişinin (Şekil 1)dan genomik sıralama için ayrıntılı olarak tarif). Bu sıralama yöntemi doğrulama Bu kağıt odak ve zaten iyice bizim önceki rapor16‘ tartışıldı.
Bu yöntem iki bölümden oluşur: bir tek tardigrade mümkün olan en düşük kirlenme ve DNA’ın piktogram düzeyleri yüksek kaliteli çıkarılması ile yalıtım. Tardigrade hasret ve antibiyotik yanı sıra su ile iyice durulanır ve herhangi bir bakteriyel kirlenme kaldırılmasını sağlamak için 500 X büyütme ile mikroskop altında görülmektedir. Önceki tahminleri ve ölçümleri tardigrade tek bir kişinin yaklaşık 50-200 pg, donma-çözülme döngüsü veya el ile homojenizasyon kitin exoskeleton çatlama tarafından çıkarılan genomik DNA16, içerdiğini gösterir. Bu genomik DNA Kütüphane İnşaat için gönderilmiş ve DNA sıralama araç üzerinde sıralı. Bir ek Bilişim Analizi yüksek kaliteli sıralama yanı sıra önceki tardigrade sıralama projeleri ile karşılaştırıldığında kontaminasyon düzeyi düşük gösteriyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriyel kontaminasyon Mikroskobik organizmaların genomik sıralama için bir tehdit oluşturuyor. Önceki çalışmalarda tardigrade genom sıralama üzerinde geniş Bilişim yöntemleri12,20kullanarak kirlenme filtre iken, genom contaminations riskini en aza indirmek için tek bir kişi üzerinden sıralı. Bireysel bir tardigrade yaklaşık 50-200 pg genomik DNA16 içerir ve kitin exoskeleton kalın bir tabaka kaplı, kirleticiler ve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Nozomi Abe, Yuki Takai ve Nahoko Ishii genomik sıralama ve teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser Grant-in-Aid tarafından Japonya Derneği Bilim promosyon (JSP’ler) araştırma görevlisi, genç bilim adamları (No.22681029) için KAKENHI Grant-in-Aid ve KAKENHI Grant-in-Aid için bilimsel araştırma (B), No. 17 H JSP’ler, 03620 tarafından desteklenmiştir bir Sumitomo Vakfı (No.140340) ve araştırma fonları Yamagata Kagawa hükümet ve Tsuruoka City, Japonya tarafından kısmen temel bilim araştırma projeleri için Grant. Tardigrades beslemek için kullanılan chlorella vulgaris Chlorella Sanayi LTD. nezaket sağlandı
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
Referências
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
