Uso in vitro de tenocytes degenerativa é essencial ao investigar a eficácia do tratamento romance na tendinopatia. No entanto, a maioria dos estudos de investigação usar apenas o modelo animal ou um tenocyte saudável. Propomos o seguinte protocolo para isolar tenocytes degenerativa humana durante a cirurgia.
Tendinopatia, uma condição dolorosa que se desenvolve em resposta à degeneração do tendão, está em ascensão no mundo desenvolvido devido ao aumento da atividade física e a esperança de vida. Apesar de sua crescente prevalência, a patogênese subjacente ainda permanece incerto, e o tratamento é geralmente sintomático. Recentemente, várias opções terapêuticas, incluindo fatores de crescimento, as células-tronco e terapia gênica, foram investigadas na esperança de aumentar a potência de cura do tendão degenerativa. No entanto, a maioria destes estudos de investigação foram realizada somente em modelos animais ou tenocytes humana saudável. Apesar de alguns estudos usando tenocytes patológico, para o melhor de nosso conhecimento não há atualmente nenhum protocolo descreve como obter tenocytes degenerativa humana. O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padrão para a aquisição de tenocytes degenerativa humana. Inicialmente, o tecido do tendão foi colhido de um paciente com epicondilite lateral durante a cirurgia. Em seguida, foram coletadas amostras de biópsia do extensor carpi radial brevis tendão correspondendo a mudanças estruturais observadas no momento da cirurgia. Todos os tendões colhidos apareceram para ser maçante, cinza, friável, e edematosa, que fez-los visualmente distintos daqueles saudáveis. Tenocytes foram cultivadas e usadas para experimentos. Entretanto, metade dos tecidos colhidos foram analisados histologicamente, e foi mostrado que partilhavam as mesmas características chaves da tendinopatia (angiofibroblástico displasia ou hiperplasia). Uma análise secundária por imunocitoquímica confirmou que as células cultivadas foram tenocytes com a maioria das células ter manchas positivas para proteínas mohawk e tenomodulin. As qualidades da natureza degenerativa de tenocytes foram então determinadas comparando-se as células com o controle saudável usando um ensaio de proliferação ou qRT-PCR. O tenocyte degenerativa exibido uma maior taxa de proliferação e padrões de expressão de gene semelhante de tendinopatia que combinasse os relatórios anteriores. Em geral, este novo protocolo poderá fornecer uma ferramenta útil para futuros estudos de tendinopatia.
Tendinopatia é uma condição de músculo-esquelética crônica degenerativa que se desenvolve em várias partes do corpo. Recentemente, o número de casos de tendinopatia aumentou consideravelmente no mundo desenvolvido devido à crescente participação em esportes recreativos e maior expectativa de vida1,2. A causa da tendinopatia é considerada multifatorial e essas causas incluem isquemia, lesões de radicais livres de oxigênio, um desequilíbrio entre inervações vasoconstritor e vasodilatador, micro-rasga interna e alterações neuro-Regulamento3 ,4,5,6,7,8. A maioria dos tratamentos para tendinopatia apenas aliviar seus sintomas. Além disso, tratamentos sem regeneração de tecidos requerem um longo tempo para reabilitação e alcançar uma resposta limitada de tendões lesionados, que impõe um desafio clínico para os médicos,9.
A incompetência de opções atuais do tratamento, juntamente com a falta de capacidade de degenerativa do tendão de auto-recuperação tem chumbo pesquisadores a ter interesse em explorar estratégias de tratamento alternativo. Recentemente, novos estudos relataram muitos resultados promissores para melhorar a eficácia de cura dos tendões tendinopatia usando fatores de crescimento, células-tronco com base em terapia e terapia de gene10,11,12.
Através de uma revisão de literatura, encontramos que os estudos envolvidos podem ser divididos em duas categorias com base em seus materiais de análise: animal modelos como um rato, um rato ou um coelho; e modelos humanos. No que se refere o modelo animal, atualmente, existem duas técnicas populares para gerar tendinopatia: indução química da lesão ou mecânico sobrecarregando o modelo. No entanto, cada modelo animal foi limitado em reproduzir o complexo humano tendinopatia patologia13,14.
A maioria dos jornais, usando amostras humanas foram analisados histologicamente ou realizado o em vitro experimento com base em um tenocyte humano saudável em vez de um tenocyte degenerativa15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. somente alguns jornais relataram que eles usaram um humano tenocyte degenerativa, mas eles não descrever em detalhe o protocolo usado para obter o tenocyte degenerativa do humano22,23. Neste contexto, note-se que resultados de sucesso do modelo animal ou o tecido saudável/tenocyte não podem necessariamente prever eficácia humana ou dosagem eficaz porque a degeneração do tendão é um processo complicado e a patogênese é Ainda não totalmente compreendidas.
Coletivamente, é necessário descrever o protocolo padrão para obter o tenocyte degenerativa do tecido humano sem causar efeitos adversos para o doador. Este artigo descreve um protocolo sobre como adquirir o tenocyte degenerativa humana. Para validar o protocolo, os tecidos colhidos foram analisados histologicamente. Em seguida, a célula culta foi confirmada como o tenocyte degenerativa usando imunocitoquímica (ICC), um quantitativo em tempo real-cadeia da polimerase (qRT-PCR) e um ensaio da viabilidade.
Um número de estudos anteriores relataram como criar modelos animais tendinopathic crônica, utilizando diferentes procedimentos como colagenase ou injeção de kartogenin, esteira correndo e mais26,,27. Embora os estudos numerosos mostraram promissores efeitos terapêuticos baseados-se nestes modelos animais, experimentos utilizando o tenocyte degenerativa humana seria cruciais no campo da tendinopatia para reproduzir a eficácia do tratamento. Neste artigo, n?…
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão da Coreia saúde tecnologia R & D projeto através da Coreia saúde indústria desenvolvimento Institute (KHIDI), que foi financiado pelo Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI16C1559).
Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
Mini-blade | Beaver | 374769 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
Collagenase Ⅱ | Sigma-Aldrich | C6885 | |
PBS | Gibco | 14190250 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
BSA | Rdtech | C0082 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |