В vitro использование дегенеративные tenocytes имеет важное значение при исследовании эффективности Роман лечения на плеча. Однако большинство исследований использовать только животную модель или здорового tenocyte. Мы предлагаем следующий протокол изолировать человека дегенеративных tenocytes во время операции.
Плеча, болезненное состояние, которое развивается в ответ на сухожилие дегенерации, находится на подъеме в развитых странах за счет увеличения физической активности и продолжительности жизни. Несмотря на его рост распространенности основной патогенез до сих пор остается неясным, и как правило симптоматическое лечение. Недавно многочисленные лечебные варианты, включая факторы роста, стволовых клеток и генной терапии, были расследованы надежде повышения исцеления потенции дегенеративных сухожилия. Однако большинство из этих исследований были проведены только на животных моделях или здорового человека tenocytes. Несмотря на некоторые исследования, используя патологических tenocytes в меру наших знаний существует в настоящее время протокол не описывается получение человека дегенеративных tenocytes. Цель этого исследования заключается в описывают стандартный протокол для получения человека дегенеративных tenocytes. Первоначально сухожильных тканей было собрано от пациента с боковой эпикондилит во время операции. Затем образцы биопсии были взяты из Карпи разгибателей запястья лучевой brevis сухожилие соответствующие структурные изменения, наблюдаемые во время хирургии. Все собранные сухожилий, как представляется, быть скучный, серый, рыхлая, и отечной, который делает их визуально отличаются от здоровыми. Tenocytes были культивировали и использоваться для экспериментов. Тем временем половина заготовленной тканей были проанализированы гистологически, и было показано, что они разделяют те же основные функции плеча (angiofibroblastic дисплазии или гиперплазия). Вторичный анализ immunocytochemistry подтвердил, что клетки культивировали tenocytes с большинством ячейки, имеющие позитивные пятна mohawk и tenomodulin белков. Качества дегенеративный характер tenocytes были затем определяется путем сравнения клетки с здорового управления, с помощью анализа распространения или qRT-PCR. Дегенеративных tenocyte отображается более высокий уровень распространения и подобных картин выражения гена из плеча, совпадающий с предыдущих докладах. В целом этот новый протокол может стать полезным инструментом для будущих исследований плеча.
Плеча является хронические дегенеративные опорно-условие, которое развивается в различных частях тела. В последнее время значительно возросло количество случаев плеча в развитых странах из-за растущего участия в рекреационных видов спорта и увеличение продолжительности жизни1,2. Считается, что причиной плеча многофакторных и эти причины включают ишемию, травмы свободных радикалов кислорода, дисбаланс между сосудосуживающие и сосудорасширяющим иннервации, внутренней микро слезы и изменения в нейро регулирование3 ,4,5,6,,78. Большинство методов лечения для плеча только уменьшить ее симптомы. Кроме того лечение без регенерации тканей требуют много времени для реабилитации и достижения ограниченный отклик от потерпевшего сухожилий, который вводит клинической проблемой для врачей9.
Некомпетентность текущих вариантов лечения наряду с отсутствием дегенеративных сухожилия способность self-heal имеет ведущих исследователей взять интерес к изучению стратегий альтернативного лечения. Недавно новые исследования сообщили многие многообещающие результаты для повышения эффективности лечения сухожилий плеча, с использованием факторов роста, стволовой терапии и генной терапии10,,1112.
Через обзор литературы, мы обнаружили, что участие исследований можно разделить на две категории, на основании их анализа материалов: животных моделей как крыса, мышь или кролика; и человека модели. Что касается модели на животных, в настоящее время существует два популярных методов для создания плеча: химической индукции травмы или механические перегрузки модель. Однако каждое животное модель была ограничена в воспроизведении сложных человеческих плеча патологии13,14.
Большинство работ с использованием человеческих образцов были проанализированы гистологически или в пробирке эксперимент, основанный на здорового человека tenocyte вместо дегенеративные tenocyte15,16,17,18 , 19 , 20 , 21. лишь несколько документов сообщили, что они использовали человека дегенеративных tenocyte, но они не описывают в деталях протокол, используемый для получения дегенеративные tenocyte от человека22,23. В этом контексте следует отметить, что успешные результаты от животной модели или здоровые ткани/tenocyte не может предсказать обязательно, человека эффективность или эффективных дозирования, потому что сухожилия дегенерации является сложным процессом и является патогенеза еще не полностью изучены.
Коллективно необходимо описать стандартный протокол для получения дегенеративные tenocyte из тканей человека не вызывая отрицательные последствия для донора. Эта статья описывает протокол о том, как приобрести человека дегенеративных tenocyte. Чтобы проверить протокол, были проанализированы гистологически заготовленной тканей. Затем культивируемых клеток было подтверждено дегенеративные tenocyte с помощью immunocytochemistry (ICC), количественные реального времени полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) и жизнеспособности assay.
Ряд предыдущих исследований сообщили как создать хронический tendinopathic животных моделей с использованием различных процедур, таких как коллагеназы или инъекций kartogenin, беговая дорожка работает и более26,27. Несмотря на многочисленные исследования показали …
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грант от Кореи медицинских технологий R & D проекта через Корея здравоохранения промышленности развития института (ХИДИ), который финансируется министерством здравоохранения и социального обеспечения, Республика Корея (номер гранта: HI16C1559).
Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
Mini-blade | Beaver | 374769 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
Collagenase Ⅱ | Sigma-Aldrich | C6885 | |
PBS | Gibco | 14190250 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
BSA | Rdtech | C0082 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |