Dejeneratif Tenocyte insanlardan elde etmek için bir protokol
Summary
Vitro dejeneratif tenocytes ne zaman tendinopathy roman tedavi etkinliğinin araştırılması temel kullanımıdır. Ancak, çoğu araştırma çalışmaları sadece hayvan modeli veya sağlıklı bir tenocyte kullanın. Biz insan dejeneratif tenocytes ameliyat sırasında yalıtmak için aşağıdaki iletişim kuralı öneriyoruz.
Abstract
Artan fiziksel aktivite ve daha uzun yaşam beklentisi nedeniyle gelişmiş dünyada yükselişte Tendinopathy, tendon dejenerasyon, tepki olarak gelişen acı bir sorunu var. Artan yaygınlık rağmen temel Patogenez hala belirsizdir ve genellikle semptomatik tedavidir. Son zamanlarda, büyüme faktörleri, kök hücre ve gen tedavisi, dahil olmak üzere çok sayıda tedavi olanakları dejeneratif tendon şifa potens arttırmak umuduyla araştırıldı. Ancak, bu araştırma çalışmaları çoğunluğu sadece hayvan modelleri ya da sağlıklı insan tenocytes yapılmıştır. Patolojik tenocytes kullanarak bazı çalışmalar rağmen bizim bilgi en iyi şekilde işte şu anda insan dejeneratif tenocytes edinme açıklayan protokol yok. Bu çalışmada insan dejeneratif tenocytes edinme standart protokol tarif etmektir. Başlangıçta, tendon doku ameliyat sırasında lateral Epikondilitte ile bir hastadan hasat. O zaman biyopsi örnekleri ameliyat anında gözlemlenen yapısal değişikliklere karşılık gelen ekstansiyon carpi komplikasyon brevis tendon dan alınmıştır. Tüm hasat ve tendonların sıkıcı, gri, kırılgan olduğu ortaya çıktı ve ödemli, onları görsel olarak sağlıklı olanlardan ayrı yapıldığı. Tenocytes kültürlü ve deneyler için kullanılan. Bu arada, yarısı hasat dokuların histolojik olarak analiz edildi ve aynı anahtar şekil-in tendinopathy (angiofibroblastic displazi veya hiperplazi) paylaşılan gösterildi. İmmunocytochemistry göre ikincil bir analiz kültürlü hücreleri mohawk ve tenomodulin proteinler için olumlu lekeleri sahip hücreleri çoğunluğu ile tenocytes olduğunu doğruladı. Tenocytes dejeneratif doğası nitelikleri sonra hücrelerin proliferasyonu tahlil veya qRT-PCR kullanarak sağlıklı kontrol ile karşılaştırarak belirlenmiştir. Dejeneratif tenocyte daha yüksek bir yayılma hızı ve önceki raporlar eşleşen tendinopathy benzer gen ifade biçimleri görüntülenir. Genel olarak, bu yeni iletişim kuralı tendinopathy gelecekteki çalışmaları için yararlı bir araç sağlayabilir.
Introduction
Tendinopathy vücudun çeşitli bölgelerinde geliştiren bir Kronik dejeneratif kas-iskelet durumdur. Son zamanlarda, tendinopathy, servis taleplerinin sayısı büyük ölçüde gelişmiş dünyada eğlence spor ve artan yaşam süresi1,2katılım büyüyen nedeniyle artmıştır. Tendinopathy nedeninin multifaktöriyel olarak kabul edilir ve bu nedenler iskemi, oksijen serbest radikal yaralanmaları, vasoconstrictor ve vazodilatör innervations, iç mikro-gözyaşları ve nöro-yönetmelik3 yapılan değişiklikler arasında bir dengesizlik ,4,5,6,7,8. En tedaviler tendinopathy için sadece onun belirtileri ortadan kaldırmaz. Ayrıca, doku rejenerasyonu olmadan tedavi rehabilitasyon için uzun zaman gerektirir ve doktorlar9için klinik bir meydan okuma dayatır yaralı tendon, sınırlı bir yanıttan elde etmek.
Mevcut tedavi seçenekleri ile birlikte duyulursa dejeneratif tendon’ın yetenek eksikliği yetersizlik kurşun araştırmacılar ormanda alternatif tedavi stratejileri keşfetmek için vardır. Son zamanlarda, yeni çalışmalar büyüme faktörleri kullanarak tendinopathy tendonlar şifalı etkinliğinin artırılması için çok umut verici sonuçlar bildirdi, kök hücre terapisi ve gen terapisi10,11,12dayalı.
Bir literatür ile ilgili çalışmalar onların analiz materyaller üzerinde dayalı iki kategoriler halinde bölünmüş bulduk: hayvan modelleri bir sıçan, fare veya bir tavşan; gibi ve insan modelleri. Hayvan modeli ile ilgili olarak, şu anda tendinopathy oluşturmak için iki popüler yöntem vardır: yaralanma veya model aşırı mekanik kimyasal indüksiyon. Ancak, her hayvan modeli karmaşık insan tendinopathy patoloji13,14üreyen sınırlı.
İnsan numuneleri kullanılarak en kartları histolojik olarak analiz edildi veya vitro gerçekleştirilen deneme dayalı bir dejeneratif tenocyte15,16,17,18 yerine sağlıklı bir insan tenocyte , 19 , 20 , 21. bir insan dejeneratif tenocyte kullandılar ama onlar insan22,23dejeneratif tenocyte almak için kullanılan iletişim kuralı ayrıntılı bir şekilde tanımlamak değil yalnızca birkaç kağıt bildirdi. Bu bağlamda, bu başarılı sonuçları hayvan modeli veya sağlıklı doku/tenocyte mutlaka insan etkinliği veya tendon dejenerasyon karmaşık bir süreç olduğu ve Patogenez etkili dozaj tahmin değil ki unutulmamalıdır hala tam olarak anlayamadım.
Topluca, donör için olumsuz etkilere yol açmadan dejeneratif tenocyte insan dokusu elde etmek için standart iletişim kuralı tanımlamak gereklidir. Bu makalede insan dejeneratif tenocyte elde etmek nasıl bir protokolünü açıklar. Protokol doğrulamak için hasat doku histolojik olarak analiz edildi. O zaman, kültürlü hücre immunocytochemistry (ICC), bir nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) ve canlılığı tahlil kullanarak dejeneratif tenocyte doğrulandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki çalışmalar bir dizi nasıl collagenase ya da kartogenin enjeksiyon, koşma koşu bandı ve daha fazla26,27gibi farklı prosedürler kullanarak kronik tendinopathic hayvan modelleri oluşturmak için rapor. Birçok çalışma bu hayvan modelleri alan umut verici tedavi edici etkileri olsa da, insan dejeneratif tenocyte kullanarak deneyler tendinopathy alanında tedavi etkinliğinin çoğaltmak için çok önemli olacaktır. Bu makalede, başarılı bir …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Kore sağlık teknoloji R & D proje ile Kore Sağlık Sanayi Geliştirme Enstitüsü (hangi Sağlık Bakanlığı ve sosyal yardım, Kore Cumhuriyeti tarafından finanse edilen KHIDI), bir hibe tarafından desteklenmiştir (sayı vermek: HI16C1559).
Materials
| Scalpel | Kisanbio | KS-Q0306-15 | No. 15 |
| Mini-blade | Beaver | 374769 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11995065 | |
| Collagenase Ⅱ | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| 50 mM ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Gibco | 15240062 | |
| 4% formaldehyde | Bio-solution | BP031 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ml | |
| BSA | Rdtech | C0082 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| MKX (C-5) | Santa cruz biotechnology | sc-515878 | |
| Tenomodulin (N-14) | Santa cruz biotechnology | sc-49325 | |
| Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| WST-1 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling Technology | #6813 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| COL3A1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00943809_m1 | |
| ACTA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00426835_g1 | |
| TAC1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00243225_m1 | |
| TACR1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00185530_m1 | |
| PTGS2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00153133_m1 | |
| ACTB | Thermo Fisher Scientific | Hs99999903_m1 | |
| Cell Strainers (100 µm) | Corning | 352360 | |
| 100mm culture dish | Thermo Fisher Scientific | 8188207 | |
| 8-well Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154534 | |
| 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3596 | |
| Nikon Eclipse 50i Microscope | Nikon | ||
| VERSA max microplate reader | Molecular Devices | ||
| CFX96 Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffins | Leica Biosystems | 3801340 | |
| Ethanol | JUNSEI CHEMICAL | 90303-2185 | |
| Hematoxylin | DAKO | CS70030-2 | |
| Eosin | DAKO | CS70130-2 | |
| Alcian blue | DAKO | AR16011-2 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Xylene | JUNSEI CHEMICAL | 25165-0430 | |
| Endogenous peroxidases | DAKO | S200380-2 | |
| Canada balsam | JUNSEI CHEMICAL | 23255-1210 | |
| Microtome Blade | FEATHER | A35 | |
| Slide glass | SUPERIOR | 1000612 | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | 101050 | |
| VEGF | Santa cruz biotechnology | sc-7269 | |
| SPSS Software | IBM | Ver. 18.0 | |
| Multi-purpose Centrifuge | LABOGENE | 1248R |
Referências
- Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
- Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
- Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40 (2012).
- Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
- Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
- Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
- Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
- Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
- Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
- Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
- Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
- Dirks, R. C., Warden, S. J. Models for the study of tendinopathy. Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).
- de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
- Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26 (2009).
- Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
- Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
- Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
- Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209 (2011).
- Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
- Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
- Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
- Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
- Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes’ patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
- Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557 (2016).
- Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
- Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), 1359-1360 (2009).
