Optimerad Scratch test för In Vitro tester av cellmigration med en automatiserad optisk kamera

Summary

Här beskriver vi ett förfarande för att testa den cell migration in vitro- med en automatiserad optisk kamera Mikroskop. Scratch analysen har använts allmänt om stängningen av scratch följs under en fastställd period. Det optiska mikroskopet ger pålitlig och billig detektering av cellmigration.

Abstract

Cellmigration är en viktig process som påverkar många aspekter av hälsa, såsom sårläkning och cancer, och det är därför avgörande för att utveckla metoder för att studera migreringen. Scratch analysen har länge varit den vanligaste in vitro- metoden att testa föreningar med anti – och pro – migration egenskaper på grund av dess låg kostnad och enkel procedur. Ett ofta rapporterade problem i analysen är dock ansamling av celler över kanten av scratch. Dessutom för att få data från analysen, måste bilder med olika exponeringar tas över en tidsperiod på exakt samma plats att jämföra förehavanden av migreringen. Olika analysprogram kan användas för att beskriva scratch nedläggningen, men de är arbetsintensivt, felaktig, och krafter cykler av temperaturförändringar. I denna studie visar vi en optimerad metod för att testa effekten migration, e.g. med de naturligt förekommande proteinerna mänskliga – och nötkreatur-Laktoferrin och deras N-terminala peptid Lactoferricin på raden epitelial cell HaCaT. En avgörande optimering är att tvätta och skrapa i PBS, vilket eliminerar nämnda ansamling av celler längs kanten. Detta kan förklaras genom avlägsnande av katjoner, som har visat sig ha en effekt på keratinocyter cell-cell-anslutning. För att säkerställa sann upptäckt av migration, lades förbehandlas med mitomycin C, en hämmare av DNA-syntes, till protokollet. Slutligen visar vi automatiserad optisk kameran, vilket eliminerar hög temperatur cykler, kroppsarbete med scratch stängning analys, samtidigt förbättra på reproducerbarhet och garanterar analys av identiska sektioner av scratch över tid.

Introduction

Migration är en viktig process som påverkar flera fysiologiska aspekter. Vid sårläkning underlättar migrering re epithelization av huden. I icke-läkande sår, till exempel kroniska sår, opportunistiska bakterier orsaka infektion i såret, och öppna sår är idealisk för bakterietillväxt och bildande av biofilm^1,2. Biofilm är en av orsakerna till utvecklingen av resistenta bakterier, som är en av de största hoten mot vårt moderna samhälle³. Vid sårläkning, immuncellerna kan inte tränga igenom biofilmen. I cancer är migration av cancerceller ett avgörande steg för metastaser, vilket är den primära dödsorsaken för patienter med solida tumörer^4,5. Därför är det avgörande att kunna studera migration.

Scratch analysen används ofta för att testa cellmigration eftersom det är billigt och enkelt att utföra på vidhäftande cellinjer, såsom fibroblast, endotelceller, och epitelceller linjer^6,7. Idag finns flera metoder för att utföra repor⁸, och olika material har rapporterats till användas, inklusive tandpetare⁹, cell scrapers¹⁰, lasrar¹¹och elektriska strömmar¹². Alla metoder har olika för- och nackdelar, och metoden bör beslutas enligt verktyget cell typ, budget och analys. Som ett exempel, om används celltyp kräver beläggning, manuellt tryck borttagning, e.g. med en tandpetare eller pipetten spets, kommer att påverka migrationen inom området, en annan metod bör användas. I denna studie kommer vi att fokusera på manuell skrapning.

En nackdelen för manuell skrapning är variationen i storlek, former av repor och ansamling av cell på kanterna av scratch. Många protokoll finns, och ett högt citerade papper råder ökad hastighet och/eller grundlig tvätt efter klia¹³. Dessutom har flera metoder använts för att minimera spridning, eftersom spridningen av cellerna inte kan särskiljas från migration och därför kan ge falskt positiva resultat av migration. Några rapporterade metoder är serum svält föregående scratch¹⁴ och minska mängden serum¹⁵. Ingen av dessa metoder kan dock se till att det finns ingen spridning. Vi redovisar därför en förbehandling av cellerna med mitomycin C att säkerställa sann resultat av migration. Mitomycin C är ett antibiotikum som hämmar DNA-syntes genom att bilda en kovalent bindning med DNA, vilket förhindrar att separera¹⁶i DNA. Genom förbehandlas med mitomycin C och tvätta med PBS innan repor, visar detekterade stängningen av klyftan sant migration av cellerna (figur 1).

Ett kännetecken av alla metoder är behovet av ett system för att analysera processen för migration¹⁷. En gemensam och en billig metod att analysera framsteg är att använda en ljus-fält Mikroskop för att ta bilder av scratch vid förutbestämda tidpunkter, följt av en analys av stängningen av klyftan i en bild programvara^18,19. Denna metod är tidskrävande, opålitliga när det gäller att ta bilder på samma plats och fokus, och rörelsen från inkubatorn till kamera tvingar cykler av temperaturförändringar medan bilderna är tagna. Andra metoder har utvecklats för att upptäcka migration genom att mäta strömflödet. Aktuella ändringar, som celler täcka mer utrymme på plattan, som läses som en ökning i impedans²⁰. Genom att mäta impedans, miljön i cellerna påverkas inte, och därför anses vara icke-invasiv. Denna metod förlitar sig på specialiserade plattor med guld elektroder, som är dyra, men de möjliggör detektering av många processer, såsom cellulär följsamhet, spridning, migration och celldöd. En stor nackdel med denna metod är att impedans mätningen inte tyder på direkt migrering, eftersom faktorer som temperatur har en stor inverkan på impedans. Förändringar i impedans kan orsakas av flera faktorer som inte granskas av mjukvaran, försvårar analysen av data. Bristen på visualisering kräver därför en konventionell ljusmikroskop att kontrollera migration.

För att övervinna många av nackdelar av tillgängliga teknik, använder vi en realtid automatiserad optisk kamera. Optiska kameran är ett system för upptäckt med ett högt dataflöde Mikroskop i en liten plattform med en lins, belysning enhet och en digitalkamera. Den har en inbyggd programvara, som kan testa migration och spridning bland annat. För att upptäcka migration, används två algoritmer för att analysera tillväxt och migration kineticsen av celler, som kallas spridning och de sårläkning analys, respektive. Spridning analysen är baserad på en två-stegs bild segmentering algoritm som gäller textur analys för att upptäcka skillnaden mellan cell-täckt områden (visas i gult), tom bakgrund områden av avancerade histogram analys. De sårläkning analys bygger på en tre-stegs-algoritm som upptäcker den cell enskiktslager, lokaliserar såret klyftan och bestämmer mellanrummet. Här bedrivs vid användarstyrda tidpunkter och data presenteras som täckt område, mellanrummet och gap område. En av de stora fördelarna med denna maskin är att det möjliggör avbildning av vidhäftande celler genom vätska på grund av vinkeln på kameran²¹. Lenstakes lutas kamerabilderna som projiceras till en z-stack på en enda z-plan generera för att säkerställa att bilder är i fokus (figur 2). z-stackar genereras genom en sammanslagning av serien av bilder (t.ex. 40) tagna vinkelrätt till såret kanten, och över hela såret. Z-stackarna kan fånga av djupet av det cell-lagret samt ett i-fokus planet över såret. Dessutom kan serien bilder sättas ihop till en videosamling i bilderna, med en knapptryckning.

Vi visar ett optimerat protokoll för upptäckt av migration i keratinocyter cell linje HaCaT. Vi testade Laktoferrin och dess N-terminala peptid, Lactoferricin, från människor och kor, för att analysera deras effekt på migration som dessa molekyler har visat sig ha många tillämpningar som antimikrobiella och immunförsvaret modulerande molekyler^{22 , 23}. de fyra föreningarna var jämfört med obehandlade HaCaT celler och epidermal tillväxtfaktor (EGF) användes som en positiv kontroll.

Protocol

Den experimentella setup har inga etiska och juridiska restriktioner och genomfördes i samförstånd med Roskilde universitet. En översikt över experimentella set-up kan ses i figur 1 och mekanismerna för optisk kameran i figur 2. 1. beredning Utföra alla steg i en steril laminärt flöde-bänk av rengöring bänken och alla utrustning med 70% etanol före starten av experimentet. Placera optisk kameran i en k…

Representative Results

HaCaT är en keratinocyter cellinje, en av de vanligast förekommande typerna av celler i huden. När ett sår uppstår, börja hudceller föröka sig och migrera över till såret sängen att stänga såret (figur 3). Båda processerna är därför av yttersta vikt för korrekt läkning. Optiska kameran kan följa båda processer i realtid. För migration, systemet ger tre datauppsättningar: cell …

Discussion

Vikten av migration i studier av utveckling, sårläkning, immunologi och cancer har lett till flera olika metoder att studera migration. Migration kan antingen vara ett uttryck för expansion eller nedläggning av klyftan av celler. Oftast stängning av scratch testas, eftersom det är lättare att odla cellerna i en enskiktslager och sedan göra en repa än växer cellerna i ett visst formulär⁸. Vår studie visar en optimerad metod för manuell avlysningen, eftersom tekniken är lätt att bemä…

Materials

oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro