Ottimizzato Scratch test per test In Vitro della migrazione cellulare con una fotocamera ottica automatizzata

Summary

Qui descriviamo una procedura per verificare la migrazione cellule in vitro con un microscopio ottico automatizzato fotocamera. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato ampiamente usato dove la chiusura del graffio è seguita per un periodo determinato. Il microscopio ottico consente un rilevamento affidabile e a buon mercato della migrazione cellulare.

Abstract

Migrazione delle cellule è un processo importante che influenza molti aspetti della salute, come ad esempio la guarigione della ferita e cancro, e, pertanto, è cruciale per lo sviluppo di metodi per lo studio della migrazione. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato a lungo il più comune metodo di in vitro per testare composti con proprietà anti – e pro – emigrazione a causa del sua basso costo e semplice procedura. Tuttavia, un problema spesso segnalati del dosaggio è l’accumulo di cellule attraverso il bordo del graffio. Inoltre, per ottenere dati del dosaggio, immagini di esposizioni diverse devono adottare per un periodo di tempo a nello stesso punto per confrontare i movimenti della migrazione. Analisi di diversi programmi possono essere utilizzati per descrivere la chiusura gratta e Vinci, ma sono ad alta intensità di manodopera, imprecise e cicli di forze delle variazioni di temperatura. In questo studio, dimostriamo un metodo ottimizzato per testare l’effetto di migrazione, ad esempio con le proteine naturale, umani e bovini-lattoferrina e loro peptide N-terminale Lactoferricin sulla linea cellulare epiteliale HaCaT. Un’ottimizzazione cruciale è quello di lavare e gratta e Vinci in PBS, che elimina il suddetto accumulo di cellule lungo il bordo. Questo potrebbe essere spiegato dalla rimozione di cationi, che sono stati indicati per avere un effetto sulla connessione cellulare dei cheratinociti. Per garantire la vera rivelazione della migrazione, pre-trattamento con mitomicina C, un inibitore della sintesi del DNA, è stato aggiunto al protocollo. Infine, dimostriamo l’automatizzato telecamera ottica, che elimina i cicli di temperatura eccessiva, lavoro manuale con analisi di chiusura sul gratta e Vinci, migliorando sulla riproducibilità e garantire un’analisi di sezioni identiche dello scratch nel corso del tempo.

Introduction

La migrazione è un processo importante che influenza diversi aspetti fisiologici. Nella guarigione delle ferite, migrazione facilita la riepitelizzazione della pelle. Nelle ferite non guariscono, quali ferite croniche, batteri opportunisti causano infezione della ferita, e ferite aperte sono ideali per la crescita di batteri e la formazione di biofilm^1,2. Biofilm è una delle cause dello sviluppo di batteri resistenti, che è una delle maggiori minacce per la nostra società moderna³. Nella guarigione della ferita, le cellule immunitarie non possono penetrare il biofilm. Nel cancro, migrazione delle cellule tumorali è un passo fondamentale della metastasi, che è la causa principale di morte per i pazienti con tumori solidi^4,5. Pertanto, è fondamentale essere in grado di studiare la migrazione.

L’analisi di gratta e Vinci è spesso usata per testare la migrazione cellulare perché è economico e facile da eseguire sulle linee cellulari aderenti, ad esempio del fibroblasto, endoteliale e delle cellule epiteliali linee^6,7. Oggi, esistono diversi metodi per l’esecuzione di graffi⁸, e diversi materiali sono stati segnalati per essere utilizzato, compreso stuzzicadenti⁹, cella raschietti¹⁰, laser¹¹e correnti elettriche¹². Tutti i metodi sono diversi Pro e contro, e il metodo dovrebbe essere decisi secondo lo strumento di analisi, budget e tipo di cella. Ad esempio, se il tipo di cella utilizzata richiede rivestimento, rimozione manuale della pressione, ad esempio con una punta di uno stuzzicadenti o una pipetta, influenzerà la migrazione all’interno dell’area, deve essere utilizzato un metodo diverso. In questo studio, ci concentreremo sulla raschiatura manuale.

Un aspetto negativo per raschiatura manuale è la variazione delle dimensioni, forme dei graffi e l’accumulazione delle cellule sui bordi del graffio. Esistono molti protocolli, e una carta più citato consigli aumentata velocità e/o lavaggio accurato dopo graffiare¹³. Inoltre, sono stati utilizzati diversi metodi per ridurre al minimo la proliferazione, poiché la proliferazione delle cellule non si distingue dalla migrazione e pertanto può dare risultati falsi-positivi della migrazione. Alcuni segnalati sono metodi deprivazione di siero precede il gratta e Vinci¹⁴ e diminuendo la quantità di siero¹⁵. Tuttavia, nessuno di questi metodi possono garantire che non c’è nessuna proliferazione. Quindi, segnaliamo un pre-trattamento delle cellule con mitomicina C per garantire risultati veri della migrazione. Mitomicina C è un antibiotico che inibisce la sintesi del DNA formando un legame covalente con il DNA, che impedisce che il DNA che separa¹⁶. Pre-trattamento con mitomicina C e lavaggi con PBS prima di graffiare, la chiusura rilevata del gap dimostra la vera migrazione delle cellule (Figura 1).

Una caratteristica di tutti i metodi è la necessità di un sistema analizzare il processo di migrazione¹⁷. Un metodo economico per analizzare lo stato di avanzamento e un comune consiste nell’utilizzare un microscopio a luce-campo per prendere immagini dello scratch in intervalli di tempo predeterminati, seguita da un’analisi della chiusura del divario in un’immagine software^18,19. Questo metodo è che richiede tempo, inaffidabili per quanto riguarda scattare foto presso il punto stesso e la messa a fuoco, e il movimento da incubatrice per fotocamera impone cicli delle variazioni di temperatura mentre le immagini sono prese. Altri metodi sono stati sviluppati per rilevare migrazione misurando il flusso di corrente. Le modifiche apportate, come celle di coprono più spazio sul piatto, che viene letto come un aumento nell’ impedenza²⁰. Misurando l’impedenza, l’ambiente delle cellule non è interessato, e il metodo è pertanto considerato invasivo. Questo metodo si basa su piatti specializzati con elettrodi d’oro, che sono costosi, ma consentono il rilevamento di molti processi, quali l’adesione cellulare, la proliferazione, migrazione e morte cellulare. Un grande svantaggio di questo metodo è che la misurazione dell’impedenza non direttamente indicare la migrazione, come fattori quali la temperatura hanno un grande impatto sull’impedenza. Modifiche nell’impedenza possono essere causate da diversi fattori che non vengono esaminati dal software, rendendo più difficile l’analisi dei dati. Di conseguenza, la mancanza di visualizzazione richiede un microscopio a luce convenzionale per verificare la migrazione.

Per superare molti degli aspetti negativi delle tecniche disponibili, usiamo una telecamera ottica automatizzata in tempo reale. La camera ottica è un sistema di rilevamento con un microscopio ad alta velocità in una piccola piattaforma con una lente, unità di illuminazione e una fotocamera digitale. Ha un built-in software, che può testare la migrazione e la proliferazione tra le altre cose. Per rilevare la migrazione, due algoritmi vengono utilizzati per analizzare la crescita e la cinetica di migrazione delle cellule, che sono chiamati la proliferazione e la cicatrizzazione analisi, rispettivamente. L’analisi di proliferazione si basa su un algoritmo di segmentazione di un’immagine in due fasi che applica texture analisi per rilevare la differenza tra zone coperte delle cellule (indicato in giallo) e vuoto aree di base di analisi Istogramma avanzato. L’analisi di cicatrizzazione è basato su un algoritmo di tre fasi che rileva il monostrato cellulare, individua il divario di ferita e determina la larghezza del gap. Questi passaggi sono condotti a intervalli di tempo definiti dall’utente, e i dati sono presentati come superficie coperta, larghezza di spacco e zona gap. Uno dei grandi vantaggi di questa macchina è che esso permette l’imaging delle cellule aderenti attraverso liquido a causa dell’angolo della telecamera²¹. Le immagini di lenstakes inclinato della telecamera che si proiettano a uno z-stack di un singolo z-plane generano per garantire che le foto sono a fuoco (Figura 2). z-stack vengono generati dalla fusione della serie di immagini (ad es. 40) prese perpendicolare al bordo della ferita e attraverso l’intera ferita. Gli z-stack consente l’acquisizione della profondità dello strato delle cellule come pure un piano di messa a fuoco attraverso la ferita. Inoltre, la serie di immagini possono essere messi insieme per una collezione di immagini, video con il clic di un pulsante.

Dimostriamo un protocollo ottimizzato per il rilevamento della migrazione nella linea cellulare dei cheratinociti HaCaT. Abbiamo testato la lattoferrina e suo peptide N-terminale, Lactoferricin, da esseri umani e mucche, per analizzare il loro effetto sulla migrazione come queste molecole hanno dimostrate di avere numerose applicazioni come antimicrobico e immunitario modulando molecole^{22 , 23}. i quattro composti sono stati confrontati con cellule HaCaT non trattate e fattore di crescita epidermico (EGF) è stato usato come controllo positivo.

Protocol

La messa a punto sperimentale non ha alcuna restrizione etici e giuridici ed è stata condotta in accordo con l’Università di Roskilde. Una panoramica della disposizione sperimentale può essere visto in Figura 1 e i meccanismi della telecamera ottica nella Figura 2. 1. preparazione Eseguire tutti i passaggi in un banco di flusso laminare sterile pulendo la panchina e tutte le attrezzature con etanolo al 70% prima dell’iniz…

Representative Results

HaCaT è una linea cellulare dei cheratinociti, uno dei tipi più abbondanti delle cellule della pelle. Quando si verifica una ferita, le cellule della pelle iniziano a proliferare e migrare sopra al letto della ferita per chiudere la ferita (Figura 3). Entrambi i processi sono, quindi, della massima importanza per la corretta guarigione. La camera ottica può seguire entrambi i processi in tempo re…

Discussion

L’importanza dell’immigrazione negli studi di sviluppo, la guarigione della ferita, immunologia ed il cancro ha portato a diversi metodi per studiare la migrazione. Migrazione può essere un’espressione dell’espansione o la chiusura del divario dalle cellule. Più spesso la chiusura del graffio viene testata, come è più facile crescere le cellule in un monostrato e poi fare un graffio che la coltivazione di cellule in una forma specifica di⁸. Il nostro studio dimostra un metodo ottimizzato per s…

Materials

oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro