체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

Summary

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

Abstract

셀 이동 건강, 암, 상처 치유 등의 여러 측면에 영향을 미치는 중요 한 프로세스 이며 그것은, 따라서, 마이그레이션 공부 방법 개발을 위한 중요 한. 스크래치 분석 결과 가장 일반적인 생체 외에서 방법 그것의 저가 및 간단한 절차 때문에 안티 프로 migration 속성으로 화합물을 테스트 하. 그러나, 분석 결과의 자주 보고 하는 문제는 처음의 가장자리에 걸쳐 세포의 축적을 이다. 또한, 분석 결과에서 데이터를 얻기 위해 다른 노출의 이미지 이동 해야 시간의 기간 동안 정확한 같은 자리에는 이동의 움직임을 비교 하. 다른 분석 프로그램 스크래치 폐쇄를 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만 그들은 노동 집약, 부정확 한, 및 온도 변화에의 힘 주기. 이 연구에서는 마이그레이션 효과, 예를 들면 자연스럽 게 발생 단백질 인간 및 소 Lactoferrin 및 그들의 N 맨끝 펩 티 드 Lactoferricin HaCaT 상피 세포 선에 대 한 최적화 된 방법을 설명 합니다. 중요 한 최적화는 세척 하 고 가장자리를 따라 셀의 상기 축적을 제거 하는 PBS에 스크래치 이다. 이 keratinocyte-셀 연결에 영향을 보여왔다 양이온의 제거에 의해 설명 될 수 있습니다. 이동의 진정한 검출을 보장 하기 위해, 미리 미토마이신 C, DNA 합성 억제제로 치료 프로토콜에 추가 되었습니다. 마지막으로, 우리는 재현성에 개선 하 고 시간이 지남에 스크래치의 동일한 섹션의 분석을 보장 하면서 자동된 광학 카메라, 과도 한 온도 사이클 제거 스크래치 폐쇄 분석, 육체 노동 방법을 보여 줍니다.

Introduction

마이그레이션 여러 생리 적 측면을 영향을 미치는 중요 한 과정 이다. 상처 치유, 마이그레이션 용이 피부 다시 epithelization. 치유 되지 않은 상처, 만성 상처 등에서 기회 주의 박테리아 상처의 감염 원인과 오픈 상처 박테리아 성장과 biofilm^1,2의 형성에 이상적입니다. Biofilm 내성 박테리아의 개발의 원인 중 하나는 우리의 현대 사회³에 가장 큰 위협 중 하나입니다. 상처 치유, 면역 세포는 biofilm을 침투 수 없습니다. 암, 암 세포의 전이의 중추적인 단계는 단단한 종양^4,5환자에 대 한 죽음의 주요 원인입니다. 따라서, 그것은 마이그레이션 공부 수 중요 합니다.

스크래치 분석 결과 종종 저렴 하 고 쉽게 부착 셀 라인, 섬유 아 세포, 내 피, 상피 세포 라인^6,7등에서 수행 하는 때문에 셀 마이그레이션 테스트 하는 데 사용 됩니다. 오늘, 흠집⁸, 수행 하기 위한 여러 가지 방법이 존재 하 고 다른 물자 보고 되었습니다 사용 되, 이쑤시개⁹, 셀 기구¹⁰, 레이저¹¹및 전기 전류¹²를 포함 하 여. 모든 방법은 장단점이 서로 다른, 그리고 방법을 따라 셀 유형, 예산 및 분석 도구에 따라 결정 되어야 한다. 예를 들어, 사용한 셀 유형 코팅, 수동 압력 제거 해야 하는 경우 예: 이 쑤 시 게 또는 피 펫 팁, 영역 내에서 마이그레이션 영향, 다른 메서드를 사용 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 수동 근 근이 살아가고에 집중할 것 이다.

수동 스크에 대 한 단점은 크기의 변형, 긁힘, 모양 및 스크래치의 가장자리에서 셀의 축적. 많은 프로토콜 존재 하는, 그리고 높게 인용 된 종이 조언 증가 속도 및/또는 긁 적¹³후 철저 한 세척. 또한, 여러 가지 방법은 세포의 확산 마이그레이션 구별 수 없습니다 있기 때문에 따라서 이동의 허위-긍정적인 결과 줄 수 있습니다 확산을 최소화 하기 위해 사용 되었습니다. 일부 메서드는 혈 청 기아 스크래치¹⁴ 이전 및 감소 하는 혈 청¹⁵의 양을 보고. 그러나,이 방법의 어느 쪽도 아니 확산은 보장할 수 있습니다. 따라서, 우리는 마이그레이션의 진정한 결과 미토마이신 C와 셀의 전처리를 보고 합니다. 미토마이신 C¹⁶분리에서 DNA를 방지 DNA와 공유 결합을 형성 하 여 DNA 합성을 억제 하는 항생제 이다. 미토마이신 C와 미리 치료 하 여 긁 기 전에 PBS로 세척 간격의 감지 된 폐쇄 세포 (그림 1)의 진정한 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.

모든 방법의 특성은 마이그레이션¹⁷의 프로세스를 분석 하는 시스템에 대 한 필요 이다. 일반적인 진행 상황을 분석 하는 싼 방법 빛 필드 현미경 이미지 소프트웨어^18,19에 간격의 폐쇄의 분석 이어서 미리 정해진된 시간 지점에서 스크래치의 이미지를 사용 하 여 것입니다. 이 방법은 시간이 많이 걸리는, 같은 자리에서 초점, 사진 촬영에 관해서 신뢰할 수 없는 고 사진을 촬영 하는 동안 카메라를 인큐베이터에서 운동 사이클의 온도 변화를 강제로 합니다. 다른 방법은 마이그레이션 전류 흐름을 측정 하 여 검출 하기 위하여 개발 되었습니다. 현재 변경 셀 임피던스²⁰증가 읽기는 접시에 더 많은 공간을 커버. 임피던스를 측정 하 여 세포의 환경 영향을 받지 않습니다, 그리고 방법을 따라서 비-침략 적으로 간주 됩니다. 이 방법은 비싸다, 골드 전극 전문된 접시에 의존 하지만 그들은 세포 부착, 확산, 마이그레이션, 세포 죽음 등 많은 프로세스 검색 사용. 이 방법의 큰 단점은 임피던스에 큰 영향을 미칠 온도 등의 요인으로 임피던스 측정 직접 마이그레이션, 표시 하지 않습니다 것입니다. 임피던스의 변화는 데이터의 분석을 더 어렵게 만드는 소프트웨어에 의해 검토 되지 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 따라서, 시각화의 마이그레이션을 확인 하려면 기존의 가벼운 현미경이 필요 합니다.

많은 사용 가능한 기술의 단점을 극복 하기 위해 우리는 실시간 자동된 광학 카메라를 사용 합니다. 광학 카메라는 렌즈, 조명 장치, 그리고 디지털 카메라와 함께 작은 플랫폼에서 높은 처리량 현미경 탐지 시스템입니다. 그것은 내장 소프트웨어를 마이그레이션 및 다른 것 들 사이에서 확산을 테스트할 수 있습니다. 마이그레이션 감지, 두 알고리즘은 성장과 확산 및 각각 분석, 치유 하는 상처 라고 하는 셀의 마이그레이션 활동을 분석 하는 데 사용 됩니다. 확산 분석은 적용 되는 텍스처 분석 셀 적용 영역 (노란색에서 표시) 간의 차이 감지 하는 2 단계 이미지 세분화 알고리즘에 따라 및 빈 고급 히스토그램 분석 영역 배경. 상처 치유 분석 셀 단층을 감지 하 고, 상처 간격을 찾습니다 하 고 간격 너비를 결정 하는 3 단계 알고리즘을 기반으로 합니다. 다음이 단계는 사용자가 지정한 시간-점에서 실시 하 고 데이터 적용된 지역, 간격 폭 및 간격 영역으로 제공 됩니다. 이 컴퓨터의 큰 장점 중 하나 이다 그 액체를 통해 부착 세포 이미징 카메라²¹의 각도 때문에. 하나의 z-비행기의 z 스택 예상 카메라 lenstakes 기울이면 이미지 사진 초점 (그림 2)을 생성 합니다. z-스택 상처 가장자리에 그리고 전체 상처에 걸쳐 수직 촬영 사진 (예: 40)의 시리즈를 병합 하 여 생성 됩니다. Z-스택 셀 계층에 초점 비행기의 깊이의 상처에서 캡처 수 있습니다. 또한, 이미지의 시리즈는 버튼의 클릭으로 이미지의 비디오 컬렉션을 함께 넣어 수 있습니다.

마이그레이션 keratinocyte 셀 라인 HaCaT에서의 검색을 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 우리 테스트 Lactoferrin 및 그것의 N 맨끝 펩 티 드, Lactoferricin, 인간과 소,이 분자 항균 및 면역 조절 분자²² 수많은 응용 프로그램을가지고 입증 되었습니다 마이그레이션에 미치는 영향 분석에서 ^{, 23}. 4 개의 화합물 치료 HaCaT 세포에 비교 했다와 표 피 성장 인자 (EGF) 긍정적인 제어로 사용 되었다.

Protocol

실험적인 체제 윤리적 및 법적 제한이 있으며 로스킬레 대학 계약 실시 했다. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1 과 그림 2에 광학 카메라의 메커니즘에서 볼 수 있습니다. 1입니다. 준비 벤치 및 실험의 시작 이전에 70% 에탄올과 모든 장비를 청소 하 여 살 균 층 류 벤치에서 모든 단계를 수행 합니다. 셀에 대 한 최적의…

Representative Results

HaCaT은 keratinocyte 셀 라인, 피부에서 가장 풍부한 셀 형식 중 하나입니다. 상처 발생, 피부 세포 증식 및 상처 침대를 닫습니다 (그림 3) 상처를 통해 마이그레이션 시작 합니다. 두 프로세스는, 그러므로, 적절 한 치료에 매우 중요. 광학 카메라는 실시간으로 두 프로세스를 따를 수 있습니다. 마이그레이션,…

Discussion

개발, 상처 치유, 면역학, 및 암 연구에 이동의 중요성 여러 다른 방법 마이그레이션 연구를 주도하 고 있다. 마이그레이션 확장의 표현 또는 셀에 의해 간격의 폐쇄 수 있습니다. 그것은 쉽게 하는 단층 세포 성장 이며 성장 하는 특정 폼⁸셀 보다 스크래치 스크래치의 가장 자주 폐쇄 테스트 됩니다. 우리의 연구는 기술 마스터 하기 쉽고 저렴 한 비용으로 수동 긁힘에 대 한 최적?…

Materials

oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro