محسن المقايسة الصفر للاختبار في المختبر للهجرة الخلية مع كاميرا بصرية الآلي
Summary
هنا يصف لنا إجراء اختبار في الخلية الهجرة في المختبر مع مجهر كاميرا بصرية الآلي. والرزن الصفر قد استخدمت على نطاق واسع حيث يتبع إقفال نقطة الصفر لفترة زمنية محددة. المجهر الضوئي تمكن من كشف خلية الهجرة رخيصة ويمكن الاعتماد عليها.
Abstract
الهجرة الخلية هو عملية هامة يؤثر على جوانب كثيرة من الصحة، مثل التئام الجروح والسرطان، وأنها، لذلك، حاسمة بالنسبة لتطوير أساليب لدراسة الهجرة. والرزن الصفر منذ فترة طويلة في المختبر الأسلوب الأكثر شيوعاً لاختبار المركبات مع خصائص migration المناهضة والمؤيدة بسبب إجراءاتها بسيطة ومنخفضة التكلفة. مشكلة كثيرا ما ذكرت للفحص غير أن تراكم الخلايا عبر الحافة من الصفر. وعلاوة على ذلك، للحصول على البيانات من المقايسة، صور التعرض مختلفة يجب اتخاذ على مدى فترة من الزمن في نفس المكان الدقيق لمقارنة حركات الهجرة. يمكن استخدام برامج التحليل المختلفة لوصف إغلاق الصفر، لكنها العمالة المكثفة، غير دقيقة، ودورات القوات للتغيرات في درجات الحرارة. في هذه الدراسة، ونظهر أسلوب أمثل لاختبار تأثير الهجرة، مثلاً مع البروتينات التي تحدث بشكل طبيعي Lactoferrin الإنسان والأبقار وعلى الطرفي ن الببتيد لاكتوفيريسين على خط الخلية الظهارية هاكات. تحسين حاسم هو الصفر في برنامج تلفزيوني، مما يلغي تراكم الخلايا على طول الحافة الآنفة الذكر ويغسل. ويمكن تفسير ذلك بإزالة الكاتيونات، التي ثبت أن يكون لها أثر على keratinocyte خلية خلية الاتصال. لضمان كشف الحقيقية للهجرة، قبل التعامل مع ميتوميسين ج، مثبط توليف الحمض النووي، تمت إضافة إلى البروتوكول. وأخيراً، علينا أن نظهر الآلي الضوئية الكاميرا، مما يلغي دورات درجة الحرارة المفرطة، والعمل اليدوي مع تحليل إغلاق الصفر، مع تحسين في إمكانية تكرار نتائج وضمان تحليل المقاطع متطابقة من الصفر على مر الزمن.
Introduction
الترحيل هو عملية هامة يؤثر على العديد من الجوانب الفسيولوجية. في التئام الجروح، يسهل الهجرة epithelization إعادة الجلد. في الجروح غير الشفاء، مثل الجروح المزمنة، البكتيريا الانتهازية تسبب العدوى للجرح، والجروح المفتوحة ومثالية لنمو البكتيريا وتشكيل بيوفيلم1،2. بيوفيلم أحد أسباب التنمية لمقاومة البكتيريا، وواحدة من أكبر الإخطار التي تهدد المجتمع الحديث لدينا3. في التئام الجروح، لا يمكن اختراق الخلايا المناعية بيوفيلم. بالسرطان، وهجرة الخلايا السرطانية خطوة محورية لورم خبيث، وهو السبب الرئيسي للوفاة للمرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة4،5. ولذلك، من الأهمية بمكان أن يكون قادراً على دراسة الهجرة.
غالباً ما يستخدم المقايسة الصفر لاختبار الهجرة الخلية لأنها رخيصة وسهلة لتنفيذ خطوط الخلية ملتصقة، مثل تنتجها الخلايا الليفية، بطانية، والخلايا الظهارية خطوط6،7. اليوم، توجد عدة طرق لأداء الخدوش8، ووردت مواد مختلفة لاستخدامها، بما في ذلك المسواك9وخلية كاشطات10وأشعة الليزر11والتيارات الكهربائية12. جميع الأساليب مختلفة من إيجابيات وسلبيات، والأسلوب ينبغي البت فيها وفقا لأداة نوع، والميزانية، وتحليل الخلية. على سبيل مثال، إذا كان يتطلب نوع الخلية المستخدمة في طلاء، إزالة الضغط اليدوي، مثلاً مع تلميح مسواك أو ماصة، سوف تؤثر الهجرة داخل المنطقة، ينبغي أن تستخدم أسلوباً مختلفاً. في هذه الدراسة، سوف نركز على إلغاء اليدوي.
الجانب سلبي القشط اليدوي هو تفاوت حجم، وأشكال خدوش، وتراكم الخلايا على الحواف من الصفر. توجد العديد من البروتوكولات، وتنصح ورقة المذكورة عالية زيادة السرعة و/أو غسيل شامل بعد الخدش13. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت عدة طرق لتقليل الانتشار، منذ انتشار الخلايا لا يمكن تمييزها عن الهجرة وذلك قد تعطي نتائج إيجابية كاذبة للهجرة. وأفادت بعض الأساليب هي المجاعة المصل السابق لنقطة الصفر14 وتناقص كمية المصل15. غير أن أيا من هذه الأساليب يمكن التأكد من أنه لا يوجد أي انتشار. ولذلك، نحن التقرير معالجة المسبقة للخلايا مع ميتوميسين ج لضمان النتائج الحقيقية للهجرة. ميتوميسين ج هو مضاد حيوي الذي يمنع تركيب الدنا عن طريق تشكيل سندات تساهمية مع الحمض النووي، مما يحول دون فصل16الحمض النووي. قبل التعامل مع ميتوميسين ج والغسيل مع برنامج تلفزيوني قبل الخدش، يوضح الكشف عن إغلاق الفجوة الحقيقية هجرة الخلايا (الشكل 1).
سمة من سمات جميع الأساليب هو الحاجة إلى نظام لتحليل عملية الهجرة17. مشتركة ووسيلة غير مكلفة لتحليل التقدم استخدام مجهر الضوء-الحقل إلى التقاط صور الصفر في نقاط زمنية محددة سلفا، تليها تحليلاً لإغلاق الفجوة في18،برمجيات صورة19. هذا الأسلوب يستغرق وقتاً طويلاً، ولا يمكن الاعتماد عليها فيما يتعلق بالتقاط الصور في نفس المكان والتركيز، وقوات الحركة من حاضنة للكاميرا دورات للتغيرات في درجات الحرارة أثناء التقاط الصور. وقد وضعت أساليب أخرى للكشف عن الهجرة عن طريق قياس التدفق الحالي. التغيرات الراهنة، كخلايا تغطي مساحة أكبر على اللوحة، نصها كزيادة في مقاومة20. بقياس مقاومة، لا يتأثر بيئة الخلايا، وذلك يعتبر الطريقة غير الغازية. يعتمد هذا الأسلوب على لوحات المتخصصة مع أقطاب الذهب، ومكلفة، إلا أنها تتيح الكشف عن العديد من العمليات، مثل انضمام الخلوية والانتشار والهجرة وموت الخلية. عيب كبير من هذا الأسلوب أن قياس مقاومة لا تشير مباشرة إلى الهجرة، كما أن عوامل مثل درجة الحرارة يكون لها تأثير كبير على المقاومة. يمكن أن يكون سبب تغييرات في المقاومة العديد من العوامل التي لا يتم مراجعتها بواسطة البرمجيات، ويزيد من صعوبة تحليل البيانات. ولذلك، يتطلب عدم وجود التصور مجهر خفيفة تقليدية للتحقق من الهجرة.
للتغلب على العديد من الجوانب السلبية للتقنيات المتاحة، نستخدم كاميرا بصرية الآلي في الوقت الحقيقي. الكاميرا الضوئية نظام كشف مع مجهر الفائق في منصة صغيرة مع عدسة، ووحدة إضاءة، وكاميرا رقمية. فقد برمجيات مدمجة، التي يمكن اختبار الهجرة وانتشار من بين أشياء أخرى. وتستخدم اثنين من خوارزميات للكشف عن الهجرة، لتحليل النمو وحركية الهجرة من الخلايا، التي تسمى الانتشار والجرح الشفاء التحليل، على التوالي. يتم تحليل انتشار استناداً إلى خوارزمية تجزئة صورة خطوتين ينطبق تحليل مادة للكشف عن الفرق بين المناطق المغطاة بالخلية (يظهر باللون الأصفر) وفارغة خلفية المناطق بتحليل الرسم البياني المتقدم. ويستند الجرح الشفاء تحليل خوارزمية الخطوات الثلاث التي يكتشف أحادي الطبقة الخلية، يحدد موقع الفجوة الجرح، ويحدد عرض الفجوة. وتجري هذه الخطوات في نقاط زمنية يحددها المستخدم، ويتم تقديم البيانات كمنطقة مغطاة وعرض الفجوة والفجوة في مجال. ومن المزايا الكبيرة لهذا الجهاز أنه يمكن تصوير الخلايا ملتصقة من خلال السائل بسبب زاوية الكاميرا21. توليد الصور لينستاكيس إمالة الكاميرا التي من المتوقع إلى كدسة z z-طائرة واحدة التأكد من وجود الصور في التركيز (الشكل 2). ض-مداخن تم إنشاؤها بواسطة دمج سلسلة الصور (مثلاً 40) اتخذت عمودي على حافة الجرح، وعبر كامل الجرح. ض-رزمة يتيح التقاط عمق طبقة الخلايا، فضلا عن طائرة في التركيز عبر الجرح. وعلاوة على ذلك، يمكن وضع سلسلة الصور معا لمجموعة فيديو من الصور، بنقرة زر واحدة.
علينا أن نظهر بروتوكولا أمثل للكشف عن الهجرة في خط الخلايا keratinocyte هاكات. نحن اختبار Lactoferrin والببتيد على الطرفي ن، لاكتوفيريسين، من البشر والأبقار، لتحليل تأثيرها على الهجرة كما أثبتت هذه الجزيئات للعديد من التطبيقات كمضادات الميكروبات والمناعة تحوير جزيئات22 , 23-كانت مقارنة مع أربعة مركبات من المركبات غير المعالجة هاكات الخلايا وعامل نمو البشرة (لو) كان يستخدم كعنصر إيجابي.
Protocol
Representative Results
Discussion
أهمية الهجرة في دراسات التنمية والتئام الجروح، وعلم المناعة والسرطان قد أدى إلى العديد من الأساليب المختلفة لدراسة الهجرة. يمكن أن تكون الهجرة أما تعبير عن التوسع أو إغلاق الفجوة بالخلايا. يتم اختبار الإغلاق في أغلب الأحيان من الصفر، كما أنه من الأسهل لتنمو الخلايا في أحادي الطبقة ومن ثم …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المجلس الدانمركي للبحوث المستقلة والتكنولوجيا والإنتاج، ومنح #4005-00029
Materials
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
| UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
| PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
| Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
| Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
Referências
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
- da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing. Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).
- Vyas, K. S., Wong, L. K. Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity. Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).
- Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces. Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).
- Monsuur, H. N., et al. Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro. Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).
- Tang, L., et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization. The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).
- Ashby, W. J., Zijlstra, A. Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration. Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).
- Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis. British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).
- Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. The effects of energy beverages on cultured cells. Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).
- Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay. Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Räsänen, K., Vaheri, A. TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).
- Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation. Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).
- Tomasz, M. Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective). Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).
- Stamm, A., Reimers, K., Strauß, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. In vitro wound healing assays – state of the art. BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 440-451 (2016).
- Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study. The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).
- Fredborg, M., et al. Real-time optical antimicrobial susceptibility testing. Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).
- Jenssen, H. Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin – An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).
- Jenssen, H., Hancock, R. E. W. Antimicrobial properties of lactoferrin. Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).
- Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. The desmosome. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).
- Ponti, A. Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. . Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).
