Otimizado zero ensaio para In Vitro testes de migração celular com uma câmera óptica automatizada

Summary

Aqui descrevemos um procedimento para testar a célula migração em vitro com um microscópio de câmara óptica automatizada. O ensaio de risco tem sido amplamente utilizado, onde o encerramento da Risque é seguido por um período. O microscópio óptico permite detecção confiável e barata de migração celular.

Abstract

Migração celular é um processo importante que influencia muitos aspectos da saúde, tais como a cicatrização de feridas e câncer, e é, portanto, crucial para o desenvolvimento de métodos para estudar a migração. O ensaio de risco tem sido o método mais comum em vitro testar compostos com propriedades anti e pro migration por causa de seu baixo custo e simples procedimento. No entanto, um problema frequentemente relatados do ensaio é o acúmulo de células através da borda da risque. Além disso, para obter dados de ensaio, imagens de diferentes exposições devem ser tomadas durante um período de tempo no mesmo lugar para comparar os movimentos de migração. Análise de diferentes programas pode ser usado para descrever o fechamento zero, mas eles são mão de obra intensiva, impreciso e forças ciclos de mudanças de temperatura. Neste estudo, vamos demonstrar um método otimizado para testar o efeito de migração, por exemplo, com as proteínas naturais, humanos e bovinos-lactoferrina e seu peptídeo N-terminal Lactoferricin na linha de células epiteliais HaCaT. Uma otimização de crucial é lavar e arranhar em PBS, que elimina o referido acúmulo de células ao longo da borda. Isso pode ser explicado pela remoção de cátions, que foram mostrados para ter um efeito sobre a conexão do celular de queratinócitos. Para garantir a verdadeira detecção de migração, pré-tratamento com mitomicina C, um inibidor da síntese de DNA, foi adicionada ao protocolo. Finalmente, vamos demonstrar a automatizado óptica câmera, que elimina os ciclos de temperatura excessiva, trabalho manual com análise de risco de encerramento, enquanto melhora na reprodutibilidade e garantir a análise de seções idênticas da risque ao longo do tempo.

Introduction

A migração é um processo importante que influencia diversos aspectos fisiológicos. Na cicatrização de feridas, migração facilita a fase de re-epitelização da pele. Em feridas não-cura, tais como feridas crônicas, bactérias oportunistas causar infecção da ferida, e feridas abertas são ideais para o crescimento de bactérias e formação de biofilme^1,2. Biofilme é uma das causas do desenvolvimento de bactérias resistentes, que é uma das maiores ameaças à nossa sociedade moderna³. Na cicatrização de feridas, as células do sistema imunológico não consegue penetrar o biofilme. Em câncer, migração de células cancerosas é um passo crucial de metástase, que é a principal causa de morte para pacientes com tumores sólidos^4,5. Portanto, é crucial poder estudar a migração.

O ensaio de zero é frequentemente usado para testar a migração celular, porque é barato e fácil de realizar em linhas de células aderentes, tais como fibroblasto, endotelial e a célula epitelial linhas^6,7. Hoje, existem vários métodos para executar arranhões⁸, e materiais diferentes foram relatados para ser usado, incluindo célula raspadores¹⁰palitos⁹, lasers¹¹e correntes elétricas¹². Todos os métodos têm diferentes prós e contras, e o método deve ser decidido de acordo com a ferramenta de tipo, orçamento e análise de célula. Por exemplo, se o tipo de célula usada necessita de revestimento, remoção de pressão manual, por exemplo, com uma ponta de palito de dente ou pipeta, influenciará a migração dentro da área, deve ser usado um método diferente. Neste estudo, focaremos na raspagem manual.

Uma desvantagem para raspagem manual é a variação do tamanho, as formas dos arranhões e acúmulo de células nas bordas da risque. Existem muitos protocolos, e um papel altamente citados aconselha aumentou a velocidade e/ou lavagem completa após coçar¹³. Além disso, vários métodos têm sido utilizados para minimizar a proliferação, uma vez que a proliferação das células não pode ser distinguida da migração e, portanto, pode dar resultados falso-positivos da migração. Alguns relataram métodos são fome soro precede o zero¹⁴ e diminuindo a quantidade de soro¹⁵. No entanto, nenhum desses métodos pode garantir que não há nenhuma proliferação. Portanto, nós relatamos um pré-tratamento das células com mitomicina C para garantir resultados verdadeiros da migração. Mitomicina C é um antibiótico que inibe a síntese de DNA, formando uma ligação covalente com o DNA, o que impede o DNA de separar¹⁶. Pré-tratamento com mitomicina C e lavagem com PBS antes de coçar, detectado encerramento do gap demonstra a verdadeira migração das células (Figura 1).

Uma característica de todos os métodos é a necessidade de um sistema analisar o processo de migração¹⁷. Um método de baixo custo para analisar o progresso e um comum é usar um microscópio de luz-campo para tirar fotos da risque em pontos de tempo pré-determinado, seguidos por uma análise do fechamento de gap em um software de imagem^18,19. Este método é demorado, não confiável com relação ao tirar fotos no mesmo lugar e foco, e o movimento da incubadora para câmera forças ciclos de mudanças de temperatura enquanto fotos são tiradas. Outros métodos têm sido desenvolvidos para detectar a migração medindo o fluxo de corrente. As alterações atuais, como células cobrem mais espaço na placa, que é lido como um aumento da impedância de²⁰. Medindo a impedância, o ambiente das células não é afectado, e o método, portanto, é considerado não-invasiva. Este método baseia-se em placas especializadas com eletrodos de ouro, que são caros, mas eles permitem a detecção de muitos processos, tais como adesão celular, proliferação, migração e morte celular. Uma grande desvantagem deste método é que a medição de impedância não indica diretamente a migração, como fatores tais como temperatura têm um grande impacto sobre a impedância. Alterações na impedância podem ser causadas por vários fatores que não são revisados pelo software, dificultando a análise dos dados. Portanto, a falta de visualização exige um microscópio de luz convencional para verificar a migração.

Para superar muitas das desvantagens das técnicas disponíveis, nós usamos uma câmera óptica automatizada em tempo real. A câmara óptica é um sistema de detecção com um microscópio de alta produtividade em uma pequena plataforma com uma lente, unidade de iluminação e uma câmera digital. Tem um built-in software, que pode testar a migração e proliferação entre outras coisas. Para detectar a migração, dois algoritmos são usados para analisar o crescimento e a cinética de migração das células, que são chamados a proliferação e a ferida que cura a análise, respectivamente. A análise de proliferação é baseado em um algoritmo de segmentação de imagens de duas etapas que se aplica a análise de textura para detectar a diferença entre as áreas cobertas de célula (mostrado em amarelo) e vazio fundo áreas por análise de histograma avançado. A análise de cicatrização de feridas é baseada em um algoritmo de três etapas que detecta a monocamada de células, localiza a abertura da ferida e determina a largura do fosso. Estas etapas são realizadas nos pontos de tempo determinados pelo usuário, e os dados são apresentados como coberta, largura do fosso e área de abertura. Uma das grandes vantagens desta máquina é que ele permite que imagens de células aderentes através de líquido por causa do ângulo da câmera²¹. As lenstakes inclinado que imagens são projetadas para uma pilha de um único plano z z geram para garantir que as fotos estão em foco (Figura 2). z-pilhas são geradas pela fusão da série de fotos (por exemplo, 40) perpendiculares à borda da ferida e através da ferida toda. Os z-pilhas permite capturar da profundidade da camada de células, bem como de um avião em foco através da ferida. Além disso, a série de imagens pode ser colocada juntos para uma coleção de vídeo das imagens, com o clique de um botão.

Vamos demonstrar um protocolo otimizado para a deteção de migração em linhagem celular de queratinócitos HaCaT. Nós testamos a lactoferrina e seu peptídeo N-terminal, Lactoferricin, com os humanos e as vacas, para analisar o seu efeito sobre a migração como estas moléculas têm demonstradas ter numerosas aplicações como antimicrobiano e imunológico, modulando as moléculas^{22 , 23}. os quatro compostos foram comparados às células não tratadas de HaCaT e fator de crescimento epidérmico (EGF) foi usado como controle positivo.

Protocol

A instalação experimental não tem nenhuma restrição ética e legal e foi conduzida de acordo com a Universidade de Roskilde. Uma visão geral sobre a montagem experimental pode ser vista na Figura 1 e os mecanismos da câmara óptica na Figura 2. 1. preparação Execute todas as etapas em um banco do fluxo laminar esterilizado por limpar a bancada e todos os equipamentos com etanol a 70% antes do início do experimento….

Representative Results

HaCaT é uma linha de celular de queratinócitos, um dos tipos de célula mais abundantes na pele. Quando um ferimento ocorre, as células de pele começam a proliferar e migrar para o leito da ferida para fechar a ferida (Figura 3). Ambos os processos são, portanto, de extrema importância para a cura adequada. A câmara óptica pode acompanhar os dois processos em tempo real. Para a migração, o…

Discussion

A importância da migração em estudos de desenvolvimento, cicatrização de feridas, imunologia e câncer levou a diversos métodos para estudar a migração. Migração pode ser uma expressão da expansão ou o fechamento da lacuna pelas células. Mais frequentemente o encerramento da Risque é testado, como é mais fácil cultivar células em um monolayer e então fazer um arranhão do que o crescimento das células em uma forma específica de⁸. Nosso estudo demonstra um método otimizado para…

Materials

oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro