Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet
Summary
We presenteren een geautomatiseerde methode voor driedimensionale wederopbouw van de Caenorhabditis elegans germline. Onze methode bepaalt het aantal en de positie van elke kern binnen de kiemcellen en analyses germline eiwit distributie en cytoskeletal structuur.
Abstract
De germline Caenorhabditis elegans (C. elegans) wordt gebruikt om verschillende biologisch belangrijke processen, met inbegrip van de cel van de stam ontwikkeling, apoptosis en chromosoom dynamiek te bestuderen. Terwijl de germline een uitstekend model is, is de analyse vaak twee dimensionale als gevolg van de tijd en de arbeid die nodig is voor de drie-dimensionale analyse. Grote uitlezingen in dergelijke studies zijn de nummer/positie van kernen en eiwit spreiding in de kiemcellen. Hier presenteren we een methode voor het uitvoeren van de geautomatiseerde analyse van de confocal microscopie en computationele benaderingen gebruiken om te bepalen van het aantal en de positie van de kernen in elke regio van de germline germline. Onze methode analyseert ook germline eiwit distributie waarmee het driedimensionale onderzoek van eiwituitdrukking in verschillende genetische achtergronden. Onze studie toont verder variaties in cytoskeletal architectuur in verschillende regio’s van de germline die rekening met specifieke eisen voor ruimtelijke ontwikkeling houden kan. Tot slot, onze methode kunt geautomatiseerde tellen van de zaadcellen in de spermatheca van elke germline. Tezamen, maakt onze methode een snelle en reproduceerbare fenotypische analyse van de C. elegans germline.
Introduction
De instandhouding van de signalering trajecten met zoogdieren maakt C. elegans een uitstekend model voor het bestuderen van meerdere biologische processen1,2. In ons lab gebruiken we de C. elegans germline te bestuderen van de cel van de stam ontwikkeling, apoptosis en genexpressie. Terwijl de germline een driedimensionale structuur is, zijn veel studies twee dimensionale het tijdrovend en arbeidsintensief karakter van drie-dimensionale analyse. Het is zeer waarschijnlijk dat de twee-dimensionale analyse in vivo gebeurtenissen in de kiemcellen kan verkeerd. De volwassen hermafrodiet van C. elegans heeft twee germline armen, die elk een somatische distale tip-cel (DTC) die distale kiemcellen in een ongedifferentieerde staat3,4 onderhoudthuizen. Deze geslachtscellen beginnen te onderscheiden als ze verder weg van de DTC, ontsnappen aan haar invloed, en worden eicellen en sperma als ze het proximale einde van de germline bereikt. Tijdens dit proces ondergaan kiem celkernen mitose, vóór de overgang naar de meiose5,6. Productie van zaadcellen wordt gecompleteerd door larvale stadium 4 (L4) van de ontwikkeling, waarna eicellen worden geproduceerd tijdens de volwassenheid. De zaadcellen worden opgeslagen in de spermatheca waar ze eicellen bevruchten tot embryo’s.
Er zijn meerdere genetische en ecologische factoren die invloed kunnen uitoefenen op germline ontwikkeling in C. elegans wat resulteert in veranderingen in het aantal kernen, aantal apoptotic evenementen, de dynamiek van het chromosoom, en eiwit expressie en/of lokalisatie7 ,8,9,10,11. De analyse van deze gebeurtenissen vereist de identificatie van elke fase van differentiatie op basis van nucleaire morfologie en distributie. Om deze parameters handmatig met de grootte van een grote steekproef nauwkeurig te analyseren is arbeidsintensief en tijdrovend. Om deze nadelen te omzeilen en om de consistentie van analyse, ontwikkelden we een automatische methode voor driedimensionale onderzoek van de C. elegans germline voor kernen tellen, kernen distributie, eiwit expressie, en cytoskeletal structuur. Door het combineren van confocale microscopie met driedimensionale rendering, we genereerden grootte en vorm parameters voor de identificatie van elk stadium van de kiem celdifferentiatie. Deze methode kan verder tellen van geslachtscellen kernen en sperma plus scoring van chromosoom nummer in elke oöcyt.
Een cruciale structuur in de kiemcellen is het cytoskelet, waarmee de stabiliteit germline compartiment aids cytoplasmatische streaming en bescherming tot germline kernen12. Met behulp van computationele rendering, we drie-dimensionale reconstructie van het cytoskelet germline uitgevoerd en afzonderlijke cytoskeletal functies binnen de germline geïdentificeerd. Hier beschrijven we een stapsgewijze protocol om te illustreren hoe computationele analyse gecombineerd met confocal imaging maakt uitgebreide analyse van de C. elegans germline.
Wij stellen voor een snelle methode voor de drie-dimensionale analyse van C. elegans germline (Figuur 1). Met behulp van drie-dimensionale analyse, is het mogelijk om te studeren het driedimensionale distributie van germline kernen (Figuur 2 pt Figuur 3), geautomatiseerde tellen van cellen (Figuur 2), reconstructie van het cytoskelet germline ( Figuur 3), distributie van eiwitten (Figuur 4), en het aantal zaadcellen in de spermatheca en chromosomen in eicellen (Figuur 5) scoren. De methode kan niet alleen gemakkelijk en nauwkeurig kwantificering van de germline maar identificeert fysiologisch relevante fenotypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit protocol is minder tijd nodig voor germline analyse te verbeteren van de nauwkeurigheid. Na standaard voorbereiding van ontleed germlines, wordt een driedimensionaal model van germline kernen bereid door computationele renderen. Terwijl het toestaan van de waarneming van germline kernen distributie in de ruimte, berekent driedimensionaal renderen het aantal kernen op specifieke regio’s van de kiemcellen. De kritische aspect van onze methode is nauwkeurige definitie van grootte en vorm parameters van kern…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Monash Microimaging voor hun technische ondersteuning. Sommige stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Dit werk werd ondersteund door een Monash University biogeneeskunde Discovery Fellowship NHMRC projectsubsidie (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) en veski innovatie fellowship: VIF 23 tot en met Roger Pocock.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
Referências
- Hubbard, E. J. Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology. Dev Dyn. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Joshi, P. M., Riddle, M. R., Djabrayan, N. J., Rothman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model for stem cell biology. Dev Dyn. 239 (5), 1539-1554 (2010).
- Kershner, A., et al. Germline stem cells and their regulation in the nematode Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 786, 29-46 (2013).
- Byrd, D. T., Knobel, K., Affeldt, K., Crittenden, S. L., Kimble, J. A DTC niche plexus surrounds the germline stem cell pool in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 9 (2), 88372 (2014).
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 405-433 (2007).
- Hansen, D., Hubbard, E. J., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Dev Biol. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crittenden, S. L., et al. A conserved RNA-binding protein controls germline stem cells in Caenorhabditis elegans. Nature. 417 (6889), 660-663 (2002).
- Eckmann, C. R., Crittenden, S. L., Suh, N., Kimble, J. GLD-3 and control of the mitosis/meiosis decision in the germline of Caenorhabditis elegans. Genética. 168 (1), 147-160 (2004).
- Schumacher, B., et al. Translational repression of C. elegans p53 by GLD-1 regulates DNA damage-induced apoptosis. Cell. 120 (3), 357-368 (2005).
- McMullen, P. D., et al. Macro-level modeling of the response of C. elegans reproduction to chronic heat stress. PLoS Comput Biol. 8 (1), 1002338 (2012).
- Hubbard, E. J., Korta, D. Z., Dalfo, D. Physiological control of germline development. Adv Exp Med Biol. 757, 101-131 (2013).
- Wolke, U., Jezuit, E. A., Priess, J. R. Actin-dependent cytoplasmic streaming in C. elegans oogenesis. Development. 134 (12), 2227-2236 (2007).
- Jones, A. R., Francis, R., Schedl, T. GLD-1, a cytoplasmic protein essential for oocyte differentiation, shows stage- and sex-specific expression during Caenorhabditis elegans germline development. Dev Biol. 180 (1), 165-183 (1996).
- Hasegawa, E., Karashima, T., Sumiyoshi, E., Yamamoto, M. C. elegans CPB-3 interacts with DAZ-1 and functions in multiple steps of germline development. Dev Biol. 295 (2), 689-699 (2006).
- Austin, J., Kimble, J. glp-1 is required in the germ line for regulation of the decision between mitosis and meiosis in C. elegans. Cell. 51 (4), 589-599 (1987).
- Berry, L. W., Westlund, B., Schedl, T. Germ-line tumor formation caused by activation of glp-1, a Caenorhabditis elegans member of the Notch family of receptors. Development. 124 (4), 925-936 (1997).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genética. 201 (1), 167-184 (2015).
- Pasierbek, P., et al. A Caenorhabditis elegans cohesion protein with functions in meiotic chromosome pairing and disjunction. Genes and Development. 15 (11), 1349-1360 (2001).
- Klass, M., Wolf, N., Hirsh, D. Development of the male reproductive system and sexual transformation in the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 52 (1), 1-18 (1976).
- Korta, D. Z., Tuck, S., Hubbard, E. J. S6K links cell fate, cell cycle and nutrient response in C. elegans germline stem/progenitor cells. Development. 139 (5), 859-870 (2012).
- Laband, K., et al. Chromosome segregation occurs by microtubule pushing in oocytes. Nat Commun. 8 (1), 1499 (2017).
