Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro
Summary
Presentiamo un metodo automatico per la ricostruzione tridimensionale della linea germinale Caenorhabditis elegans . Il nostro metodo determina il numero e la posizione di ogni nucleo all’interno del germline e la distribuzione di analisi germinale della proteina e la struttura del citoscheletro.
Abstract
La linea germinale Caenorhabditis elegans (c. elegans) è usata per studiare i diversi processi biologicamente importanti tra cui dinamiche di sviluppo, apoptosi e cromosoma della cellula formativa. Mentre la linea germinale è un eccellente modello, l’analisi è spesso due dimensioni a causa del tempo e la manodopera necessaria per l’analisi tridimensionale. Principali letture in tali studi sono il numero/posizione dei nuclei e della distribuzione della proteina all’interno della linea germinale. Qui, presentiamo un metodo per eseguire l’analisi automatica della linea germinale usando microscopia confocale e approcci computazionali per determinare il numero e la posizione dei nuclei in ogni regione della linea germinale. Il nostro metodo analizza anche distribuzione di proteina di germline che consente l’esame tridimensionale dell’espressione proteica in differenti ambiti di provenienza genetici. Ulteriormente, il nostro studio mostra variazioni nell’architettura del citoscheletro in regioni distinte della linea germinale che può ospitare fino a specifiche esigenze di sviluppo spaziale. Infine, il nostro metodo consente un conteggio automatizzato dello sperma nella spermateca di ogni linea germinale. Presi insieme, il nostro metodo permette l’analisi fenotipica rapida e riproducibile della linea germinale di c. elegans .
Introduction
La conservazione delle vie con i mammiferi di segnalazione rende c. elegans un eccellente modello per studiare più processi biologici1,2. Nel nostro laboratorio, utilizziamo la linea germinale di c. elegans per studiare lo sviluppo delle cellule staminali, apoptosi e l’espressione genica. Mentre la linea germinale è una struttura tridimensionale, molti studi sono due dimensioni a causa della natura molto tempo e laborioso di analisi tridimensionale. È molto probabile che l’analisi bidimensionale può travisare in vivo gli eventi sulla linea germinale. L’ermafrodita adulto di c. elegans ha due braccia di germline, ognuno dei quali ospita una cellula somatica punta distale (DTC) che mantiene le cellule germinali distale in un stato indifferenziato3,4. Queste cellule germinali iniziano a differenziarsi come essi allontana il DTC, sfuggire la sua influenza e diventare ovociti e spermatozoi come raggiungono l’estremità prossimale della linea germinale. Durante questo processo, i nuclei delle cellule di germe subiscono la mitosi, prima di passare ai meiosi5,6. Produzione di spermatozoi è completata da stadio larvale 4 (L4) dello sviluppo, dopo di che gli ovociti sono prodotte durante l’età adulta. Gli spermatozoi vengono archiviati nella spermateca dove essi fertilizzare gli ovociti per generare embrioni.
Non ci sono più fattori genetici e ambientali che possono influenzare lo sviluppo di germline in c. elegans conseguente cambiamenti nel numero dei nuclei, il numero di fenomeni apoptotici, dinamiche del cromosoma e l’espressione della proteina e/o localizzazione7 ,8,9,10,11. L’analisi di questi eventi richiede l’identificazione di ogni fase di differenziazione basata sulla distribuzione e la morfologia nucleare. Per analizzare con precisione questi parametri manualmente con un campione di grandi dimensioni è laborioso e che richiede tempo. Per aggirare questi inconvenienti e per consentire la coerenza dell’analisi, abbiamo sviluppato un metodo automatizzato per l’esame tridimensionale della linea germinale per nuclei di conteggio, distribuzione di nuclei, espressione della proteina, c. elegans e del citoscheletro struttura. Combinando la microscopia confocale con rendering tridimensionale, abbiamo generato i parametri di dimensione e forma per l’identificazione di ogni fase di differenziazione delle cellule di germe. Inoltre, questo metodo consente di conteggio dei nuclei delle cellule di germe e sperma più segnando del cromosoma in ogni ovocita.
Una struttura fondamentale nella linea germinale è il citoscheletro, che fornisce stabilità al vano di germline, aids flusso citoplasmatico e protezione di germline nuclei12. Utilizzando il rendering computazionale, abbiamo eseguito la ricostruzione tridimensionale del citoscheletro germline ed abbiamo identificato caratteristiche distinte proteine citoscheletriche entro la linea germinale. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo per illustrare come computazionale analisi combinata con confocale imaging consente analisi completa della linea germinale di c. elegans .
Proponiamo un metodo rapido per l’analisi tridimensionale di germline di c. elegans (Figura 1). Utilizzando analisi tridimensionale, è possibile studiare la distribuzione tridimensionale dei nuclei di germline (Figura 2 e Figura 3), automatizzato di conteggio delle cellule (Figura 2), ricostruzione del citoscheletro germinale ( Figura 3), distribuzione delle proteine (Figura 4) e segnando il numero di spermatozoi nella spermateca e cromosomi negli ovociti (Figura 5). Il metodo non solo consente il facile e precisa quantificazione della linea germinale, ma identifica fenotipi fisiologicamente rilevanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo del presente protocollo è quello di migliorare la precisione e ridurre il tempo necessario per l’analisi di germline. Dopo preparazione standard del germlines dissecata, un modello tridimensionale dei nuclei di germline è preparato dal rendering computazionale. Pur consentendo l’osservazione della distribuzione di nuclei di germline nello spazio, rendering tridimensionale calcola il numero dei nuclei alle regioni specifiche della linea germinale. L’aspetto critico del nostro metodo è accurata definizione d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Monash Microimaging per il loro supporto tecnico. Alcuni ceppi sono stati forniti dal centro Caenorhabditis genetica, che è finanziato dall’ufficio di NIH di programmi di ricerca dell’infrastruttura (P40 OD010440). Quest’opera è stata sostenuta da un Monash University biomedicina Discovery Fellowship, NHMRC progetto Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) e veski fellowship di innovazione: VIF 23 a Roger Pocock.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
Referências
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