Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto
Summary
Presentamos un método automatizado para la reconstrucción tridimensional de lo elegans de Caenorhabditis del germline. Nuestro método determina el número y la posición de cada núcleo dentro de la línea germinal y análisis del germline proteínas distribución y estructura citoesquelética.
Abstract
La línea germinal de Caenorhabditis elegans (C. elegans) se utiliza para estudiar varios procesos biológicamente importantes, incluyendo dinámicas de desarrollo, apoptosis y el cromosoma de la célula de vástago. Mientras que la línea germinal es un excelente modelo, el análisis es a menudo dos dimensional debido al tiempo y mano de obra necesaria para el análisis tridimensional. Lecturas principales en estos estudios son la posición y número de núcleos y la distribución de la proteína dentro de la línea germinal. Aquí, presentamos un método para realizar el análisis automatizado de la línea germinal con microscopia confocal y los enfoques computacionales para determinar el número y posición de los núcleos en cada región de la línea germinal. Nuestro método analiza también la distribución de la proteína del germline que permite el examen tridimensional de expresión de proteínas en diferentes fondos genéticos. Además, nuestro estudio muestra las variaciones en la arquitectura citoesquelética en regiones distintas de la línea germinal que puede acomodar a los requisitos específicos de desarrollo espaciales. Por último, nuestro método permite conteo automatizado de los espermatozoides de la espermateca de cada línea germinal. Tomados en conjunto, nuestro método permite el análisis fenotípico rápido y reproducible de la línea germinal de C. elegans .
Introduction
La conservación de la señalización de las vías con los mamíferos hace C. elegans un excelente modelo para estudiar varios procesos biológicos1,2. En nuestro laboratorio utilizamos el germline de C. elegans para estudiar el desarrollo de la célula de vástago, apoptosis y expresión génica. Mientras que la línea germinal es una estructura tridimensional, muchos estudios son dos dimensiones debido a la naturaleza desperdiciadora de tiempo y mano de obra intensiva de análisis tridimensional. Es muy probable que el análisis de dos dimensiones pueden tergiversar en vivo eventos en la línea germinal. El hermafrodita adulto de C. elegans tiene dos brazos del germline, que alberga una célula somática punta distal (DTC) que mantiene las células de germen distales en un estado indiferenciado3,4. Estas células germinales empiezan a diferenciar como se alejan de la DTC, escapar de su influencia y se convierten en ovocitos y los espermatozoides que alcanzan el extremo proximal de la línea germinal. Durante este proceso, núcleos de la célula de germen sufren mitosis, antes de hacer la transición a la meiosis5,6. La producción de espermatozoides se completa con la etapa de larvas 4 (L4) del desarrollo, después de lo cual se producen óvulos durante la edad adulta. Los espermatozoides se almacenan en la espermateca donde fertilizan óvulos para generar embriones.
Hay múltiples factores genéticos y ambientales que pueden influir en el desarrollo del germline en C. elegans , dando por resultado cambios en el número de núcleos, número de eventos apoptóticos, dinámica del cromosoma y expresión de la proteína o localización7 ,8,9,10,11. El análisis de estos eventos requiere la identificación de cada etapa de diferenciación basada en la distribución y morfología nuclear. Para analizar con precisión estos parámetros manualmente con un tamaño de muestra grande es trabajosa y requiere mucho tiempo. Para eludir estos inconvenientes y la consistencia del análisis, hemos desarrollado un método automatizado para examen tridimensional del C. elegans del germline para conteo de núcleos, distribución de los núcleos, expresión de la proteína y citoesqueleto estructura. Mediante la combinación de microscopía confocal con representación tridimensional, nos genera parámetros de tamaño y forma para la identificación de cada etapa de la diferenciación de la célula de germen. Además, este método permite conteo de núcleos de la célula de germen y el esperma más puntuación del número de cromosomas en cada ovocito.
Una estructura crucial en la línea germinal es el citoesqueleto, que proporciona estabilidad al compartimiento del germline, SIDA citoplasmática y protección a germline núcleos12. Utilizando procesamiento computacional, se realizó la reconstrucción tridimensional del citoesqueleto del germline e identificaron citoesqueleto características dentro de la línea germinal. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para ilustrar cómo computacional análisis combinado con proyección de imagen confocal permite análisis completo de la línea germinal de C. elegans .
Proponemos un método rápido para el análisis tridimensional de C. elegans del germline (figura 1). Utilizando el análisis tridimensional, es posible estudiar la cuenta de la distribución tridimensional de los núcleos de la línea germinal (figura 2 y figura 3), automatizado de células (figura 2), reconstrucción del citoesqueleto del germline ( Figura 3), la distribución de las proteínas (figura 4) y anotar el número de espermatozoides de la espermateca y cromosomas en los óvulos (figura 5). El método no permite fácil y precisa la cuantificación de la línea germinal sólo identifica fenotipos fisiológicamente relevantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este protocolo es mejorar la precisión y reducir el tiempo requerido para el análisis de la línea germinal. Después de la preparación estándar de germlines disecada, un modelo tridimensional de los núcleos de la línea germinal se prepara por procesamiento computacional. Permitiendo la observación de la distribución de los núcleos del germline en el espacio, representación tridimensional calcula el número de núcleos en regiones específicas de la línea germinal. El aspecto crítico de nuestro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Monash Microimaging por su apoyo técnico. Algunas cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis , que es financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue financiado por Monash University biomedicina descubrimiento beca, subvención del proyecto NHMRC (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) y beca de innovación veski: 23 VIF a Roger Pocock.
Materials
| C. elegans strains: wild type (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| OP50 Escherichia coli bacteria | Homemade | ||
| Nematode Growth Media (NGM) plates | Homemade | ||
| polyclonal rabbit anti-REC-8 | SDIX | 29470002 | |
| Alexa 488 conjugated antibody raised in goat | Thermofisher Scientific | A-21236 | |
| Cytoskeletal dye phalloidin | Thermofisher Scientific | A-12380 | |
| DAPI | Thermofisher Scientific | 62248 | |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P5899 | |
| Tetramisol | Sigma Aldrich | P5899 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
| 1M HEPES buffer, pH 7.4 | Sigma Aldrich | G0887 | |
| 10X PBS pH 7.4 | Thermofisher Scientific | AM9625 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1389 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| 37% Paraformaldehyde solution | Merck Millipore | 1040031000 | |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Fluoroshield fixing reagent | Sigma Aldrich | F6182 | |
| Ethanol | Millipore | 1009832511 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| 20°C & 25°CIncubator | Any brand | ||
| Light microscope | Any brand | ||
| Confocal microscope | Any brand (Leica, Zeiss) | ||
| Computer equipped with Imaris suit 8.4.1 or later version, full licence to use the software and Matlab software. | Bitplane | ||
| Phospho buffered saline, pH 7.4 | Homemade | ||
| Teflon microscope slides | Tekdon | 941-322-8288 |
Referências
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