מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון
Summary
עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז’ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.
Abstract
הקרנה עבור אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות שמרים 2-היברידית וזמינותו כבר זמן רב כלי יעיל, אך השימוש בה במידה רבה הוגבלה לגילוי של interactors גבוהה-זיקה כי הם מאוד מועשרים בספריה של מועמדים אינטראקציה. בתבנית מסורתית, שמרים 2-היברידית וזמינותו יכולות להניב מושבות רבות מדי לנתח כאשר ניצח ב לכתחילה נמוך שבו זיקה נמוכה interactors שעשויים להימצא. יתר על כן, ללא חקירה מקיפה ושלמה של הספרייה אותו נגד פלסמידים שונים פיתיון, ניתוח השוואתי אינה יכולה להיות מושגת. למרות חלק מבעיות אלו ניתן לטפל באמצעות ספריות טרף ערוכים, עלות והתשתיות הדרושים להפעלת מסכי כזה יכול להיות אסורה. כחלופה, אנו הסתגלו שמרים 2-היברידית וזמינותו לחשוף בו זמנית עשרות ארעי, אינטראקציות חלבון סטטי בתוך מסך אחד ניצול אסטרטגיה כינה DEEPN (העשרה דינמי עבור הערכה של חלבונים רשתות), אשר משלבת רצפי DNA תפוקה גבוהה וחישוביות לעקוב אחר ההתפתחות של אוכלוסיה של פלסמידים אשר קידוד שותפים אינטראקציה. כאן, אנו מתארים ריאגנטים מותאם אישית ופרוטוקולים לאפשר מסך DEEPN להורג בקלות וביעילות.
Introduction
הבנה מלאה של התהליכים הביולוגיים תא מסתמך על מציאת הרשתות אינטראקציית חלבון העומדים בבסיס המנגנונים המולקולריים שלהם. גישה אחת כדי לזהות אינטראקציות חלבון הוא וזמינותו (Y2H) 2-היברידית שמרים, אשר עובד על ידי הרכבת פקטור שעתוק chimeric מתפקדת ברגע חלבון שני, תחומי עניין לאגד בזו1. מסך Y2H טיפוסי מבוצע על-ידי יצירת אוכלוסייה של שמרים כי בתים בשני ספריה של פלסמידים קידוד חלבונים שמעצבת דבוקה מפעיל גנים ברמת השעתוק (למשל., “טרף” חלבון כימרי) ולא על פלסמיד נתון “פיתיון” המורכבת של החלבון עניין התמזגו לתחום איגוד ה-DNA (למשל, התחום Gal4 DNA-איגוד המאגד רצף הפעלת נגד הזרם-Gal4). אחד היתרונות העיקריים של הגישה Y2H היא כי קל יחסית זול לבצע במעבדה טיפוסי מצויד עבור עבודה שוטפת ביולוגית מולקולרית2. עם זאת, כאשר מבוצעת באופן מסורתי, משתמש דוגמאות בודדות מושבות שעולות בעת הבחירה עבור השפעה חיובית הדדית Y2H. זה קשות מגביל את המספר של ספריית “טרף” שיבוטים זה יבדקו. בעיה זו היא הופכת למורכבת יותר כאשר השפע של טרף אינטראקציה מסוימת היא גבוהה מאוד ביחס לאחרים, צמצום הסיכוי של גילוי האינטראקציה של פלסמידים לטרף השפע נמוכה.
פתרון אחד לשימוש העיקרון Y2H ב כיסוי מקיף של פרוטאום הוא השימוש בגישה בתבנית מטריצה שבה מערך המכיל טרף בודדים הידועים פלסמידים יכולים דיגיטלית להיחקר. עם זאת, גישה כזו דורשת תשתית אינו נגיש בקלות או חסכונית לחוקרים בודדים אשר מעוניינים מגדיר את interactome של מספר קטן של חלבונים או תחומים3. בנוסף, ספריות טרף מאוד מורכב יכול לקודד שברים מרובים של חלבונים שמעצבת להרחיב גודל כזה מערכים מטריקס גדלים מעשית. חלופה אחת היא לבצע מבחני עם ספריות מורכבים בקבוצות להעריך את הנוכחות של אינטראקציה שיבוטים שימוש מסיבי מקביל בתפוקה גבוהה רצף4. זה ניתן ליישם assay הנוכחות של פלסמידים טרף העולות מושבות מרובות באמצעות טיפוסי Y2H מעוצב הגישה שמרים אילו תאים דיור בזוג אינטראקציה של חלבונים פיוז’ן רשאים לגדול על צלחת5,6. זה הרעיון הכללי יכול להיות הדגישה להגדיל השאילתה של שני פיתיון מרובים, טרף רכיבים באותו זמן7,8.
עדיין, חקירות רבות דורשות שקל יותר עדיין מתרכז יותר מאמץ רק כמה חלבון “פיתיונות’, יכולים ליהנות יותר על-ידי שאילתת ממצה, חצי כמותית של ספריה טרף מורכבת אחת. יש שפותחה ואנו לאימות גישה לביצוע מחקרים אינטראקציה חלבון בהיקף נרחב באמצעות עיקרון Y2H אצווה תבנית4. זה משתמש קצב התרחבות פלסמיד מסוים טרף כמייצג העוצמה היחסית של האינטראקציה Y2H9. רצף עמוק של פלסמידים כל בתוך אוכלוסיה נתון הצמיחה רגילה או תנאי הגידול סלקטיבי מייצר מפה מלאה של שיבוטים המניבים אינטראקציות Y2H חזקות או חלשות. הרפרטואר של interactors יכול להיות שהושג, בהשוואה ישירות על פני פלסמידים מרובים פיתיון. זרימת העבודה וכתוצאה מכך כינה DEEPN (דינמי העשרה עבור הערכה של חלבונים רשתות) וכך ניתן לזהות interactomes דיפרנציאלית מספריות טרף אותו לזהות חלבונים, המאפשר השוואה בין חלבון אחד לעומת אחר.
. הנה, נדגים DEEPN להציג שיפור שיטות מעבדה זה להקל על השימוש בו, אשר מתוארים באיור1. שיפורים משמעותיים כוללים:
דור של אוכלוסיות השמרים טרף. אחת מהדרישות מפתח של DEEPN מייצר אוכלוסיות של שמרים עם פלסמידים שונים פיתיון שיש מאותה התפלגות של ספריות טרף פלסמיד. אוכלוסיות בסיסית המקבילה של הספרייה פלסמיד טרף חיוניים לייצור מדויק השוואות בין interactomes של פיתיונות שונים. זו מושגת בצורה הטובה ביותר כאשר פלסמיד ספריית שוכן כבר בקרב אוכלוסיה שמרים הפלואידי, לגור פלסמיד הפיתיון נתון של האוכלוסייה הזאת מושגת על ידי הזדווגות לייצר דיפלואידי. כאן, אנו מספקים מדריך ברור באיך להכין כזה אוכלוסיות באמצעות ספריות מסחריים בבניין שמרים הפלואידי. אמנם מצאנו שיטות לייצר מספר רב של diploids, היעילות הכוללת ההזדווגות של מסחרי ספריית המכילים שמרים זנים אלו היה נמוך. לכן, אנחנו נבנה זן חדש אשר יכול בית ספריות טרף המניבה diploids הרבה יותר לכל ההזדווגות התגובה.
ניו סט פתיונות פלסמידים. פלסמידים הנוכחי רבים המבטאים “פיתיון” פיוז’ן חלבונים מורכבת של החלבון של עניין לתחום ה-DNA מחייב הם מבוססי 2µ, ומאפשר להם להגביר את מספר העותק שלהם. מספר עותק זה יכול להיות משתנה מאוד באוכלוסייה, להוביל השתנות בתגובה תעתיק Y2H. זה בתורו יכול להטות את היכולת לאמוד את עוצמת האינטראקציה חלבון נתון בהתבסס על התגובה צמיחה של תאים תחת בחירת. זו יכולה להיות חלקית כתובת על-ידי שימוש של פלסמיד עותק נמוכה, אשר חלקם תוארו קודם לכן כגון זמינים מסחרית pDEST3210. ואנחנו נבנה על חדש פיתיון פלסמיד (pTEF-GBD) מייצרת Gal4 DNA-מחייב תחום היתוך חלבונים בתוך פלסמיד מבוססי צנטרומר עותק נמוך TRP1 נושא את הגן ההתנגדות Kanr המאפשר גם שיבוט של פיתיון קטעים שני במעלה הזרם, במורד הזרם של התחום מחייב Gal4 DNA.
ספריית קטע חדש בצפיפות גבוהה Y2H. אנו נבנה על פלסמיד חדש לספריות טרף Y2H הבית, השתמשו בו כדי לבנות ספרייה Y2H מורכב מסיבים של אקראי הוטו שברי DNA גנומי האפייה. ניתוח רצף הראו כי בספריה זו היה מעל 1 מיליון רכיבים שונים, הרבה יותר מורכב מאשר שמרים שתואר לעיל גנומית Y2H פלסמיד ספריות11. עם הספרייה החדשה, הצלחנו להראות זרימת העבודה DEEPN יציבה מספיק כדי להכיל את ספריות מורכב עם הרבה פלסמידים שונים באופן אמין, לשחזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מספקים מדריך כיצד לבצע מבחני Y2H אצווה באמצעות שיטות אופטימיזציה. ישנם כמה צעדים קריטיים במסגרת ההליך כדי לסייע להבטיח כי האוכלוסייה של שמרים כי להימצא תחת הבחירה הוא נציג של הספרייה ההתחלה, כי מספיק של האוכלוסייה שמרים המוצא משמש בתהליך הבחירה כדי להגביל את השתנות . חשוב לציין, אמו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לצוות בתוך המכון לגנטיקה אנושית על הגדרות ספריית הכנה ורצף. אנו מודים עינת שניר על המומחיות שלה בהכנת שברי ספרייה גנומית של הספריה פלסמיד Y2H כאן. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: NIH R21 EB021870-01A1, על ידי ה-NSF מחקר פרויקט מענק: 1517110.
Materials
| Illumina HiSeq 4000 | Illumina | deep sequencing platform | |
| Monoclonal anti-HA antibodies | Biolegend | 901514 | Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs |
| Polyclonal anti-myc antibodies | QED Biosciences Inc | 18826 | Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs |
| NarI | New England BioLabs | R0191S | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3236S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| Polyethylene Glycol 3350, powder | J.T. Baker | U2211-08 | |
| Salmon Sperm DNA | Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific | 50-948-286 | carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1. |
| Kanamycin Monosulfate | Research Products International | K22000 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | used for making DNA agarose gels |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23025 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060 | |
| D-Sorbitol | Research Products International | S23080 | |
| Lithium Acetate Dihydrate | MP Biomedicals | 155256 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | C79 | |
| EDTA Sodium Salt | Research Products International | E57020 | |
| Yeast Extract Powder | Research Products International | Y20020 | |
| Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids | Research Products International | Y20040 | |
| CSM-Trp-Leu+40ADE | Formedium | DCS0789 | |
| CSM-Trp-Leu-His+40ADE | Formedium | DCS1169 | |
| CSM-Leu-Met | Formedium | DCS0549 | |
| CSM-Trp-Met | Bio 101, Inc | 4520-922 | |
| L-Methionine | Formedium | DOC0168 | |
| Adenine | Research Products International | A11500 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International | G32045 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | used for making media plates in section 1 |
| Peptone | Research Products International | P20240 | |
| 3-amino-1,2,4 Triazole | Sigma | A8056 | |
| 2-Mercaptoehanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Zymolyase 100T | USBiological | Z1004 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P8281 | |
| Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9732 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 238074 | |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC | 2716 | |
| RNAse A | ThermoFisher | EN0531 | |
| Urea | Research Products International | U20200 | |
| SDS | Research Products International | L22010 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Tris-HCl | Gibco | 15506-017 | |
| bromophenol blue | Amresco | 449 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510S | Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2 |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541S | Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1 |
| Ethidium Bromide | Amresco | 0492-5G | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Used for purification of pcr products in section 6.2.3 |
| Qiaquick DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1 |
| KAPA Hyper Prep kit | KAPA Biosystems | KK8500 | preparation kit for deep sequencing |
| Codon optimization | http://www.jcat.de | ||
| Codon optimization | https://www.idtdna.com/CodonOpt | ||
| gBlocks | Integrated DNA Technologies | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
| Strings | Thermofisher | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
| GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit | EPOCH Life Sciences | Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3 | |
| Covaris E220 | Covaris | high performance ultra-sonicator in section 7 | |
| oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
| oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
| PJ69-4A MatA yeast strain | http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 | MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7 | |
| pTEF-GBD | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-DNA binding doimain expression plasmid | |
| PLY5725 MATalpha yeast strain | Dr. Robert Piper Lab | MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆ | |
| pGal4AD (pPL6343) | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-activation domain expression plasmid | |
| 100 mm petri dishes | Kord-Vallmark sold by VWR | 2900 | |
| 125 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63270 | |
| 250 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| 1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63275 | |
| 20 X 150 mm Disposable Culture Tube | Thermofisher | 14-961-33 | |
| pipet-aid | Drummond | 4-000-100 | |
| 5 mL Serological Pipette | Denville | P7127 | |
| 10 mL Serological Pipette | Denville | P7128 | |
| 25 mL Serological Pipette | Denville | P7129 | |
| 1,000 mL PYREX Griffin Beaker | Fisher Scientific | 02-540P | |
| 1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
| 1,000 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6G | |
| SpectraMax 190 | Molecular Devices | used to measure the Optical Density of cells | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Spectrophotometer used to quantify amount of DNA |
| Electronic UV transilluminator | Ultra Lum | MEB 20 | used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel |
| P1000 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123602G | |
| P200 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123601G | |
| P20 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123600G | |
| P10 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F144802G | |
| 1250 µL Low Retention Pipette Tips | GeneMate | P-1236-1250 | |
| 200 µLLow Retention Pipette Tips | VWR | 10017-044 | |
| 10 µL XL Low Retention Pipette Tips | VWR | 10017-042 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 490001-627 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 490001-621 | |
| cell scraper | Denville Scientific | TC9310 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| HCl | Fluka Analytical | 318949-1L | |
| NaOH | J.T. Baker | 5674-02 | |
| Wooden applicators | Solon Care | 55900 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424 | Fisher Scientific | 05-400-005 | microcentrifuge |
| Sorvall ST16R | Thermo Fisher Scientific | 75004381 | benchtop centrifuge |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare | NA934-1ML | Secondary Antibody |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Secondary Antibody |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | ECL detection solution |
| Isotemp Incubator | Thermo Fisher Scientific | Incubator | |
| Mutitron 2 | INFORS HT | Shaking incubator | |
| Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 | Fisher Scientific | water bath | |
| Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) | Clontech | 630482 | commercially available cDNA Library |
| Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) | Clontech | 630488 | commercially available cDNA Library |
| pGADT7 AD Vector | Clontech | 630442 | commercially available AD Vector housing many cDNA libraries |
| pGBKT7 DNA-BD Vector | Clontech | 630443 | commercially available DNA-BD Vector |
| Biolase DNA Polymerase | Bioline | BIO-21042 | DNA polymerase used for section 2.4 |
| GeneMate GCL-60 Thermal Cycler | BioExpress | P-6050-60 | pcr machine |
| TempAssure 0.5 mL PCR tubes | USA Scientific | 1405-8100 |
Referências
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
- Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
- Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
- Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
- Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
- Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
- Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
- Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
- James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genética. 144 (4), 1425-1436 (1996).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
- Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).
