Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Summary

Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

Abstract

Triagem para interações da proteína-proteína usando o ensaio de 2-híbrido de levedura tem sido uma ferramenta eficaz, mas seu uso foi em grande parte limitado à descoberta de interactianos de alta afinidade que são altamente enriquecido na biblioteca dos candidatos interagindo. Em um formato tradicional, o ensaio 2-híbrido de levedura pode render muitas colônias para analisar quando conduzido no rigor baixa onde os interactianos de baixa afinidade podem ser encontrados. Além disso, sem uma interrogação abrangente e completa da mesma biblioteca contra diferentes isca plasmídeos, uma análise comparativa não pode ser alcançada. Embora alguns destes problemas podem ser abordados usando bibliotecas de matriz presa, o custo e a infra-estrutura necessária para operar essas telas podem ser proibitivos. Como alternativa, adaptámos o ensaio 2-híbrido de levedura para descobrir simultaneamente dezenas de transiente e interações proteína estático dentro de uma única tela utilizando uma estratégia denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteínas), que incorpora o sequenciamento de DNA do elevado-throughput e computação para acompanhar a evolução de uma população de plasmídeos que codificam parceiros interagindo. Aqui, descrevemos reagentes personalizados e protocolos que permitem que uma tela DEEPN a ser executado de modo fácil e econômico.

Introduction

Um entendimento completo dos processos biológicos de célula depende de encontrar as redes de interação de proteínas que fundamentam seus mecanismos moleculares. Uma abordagem para identificar as interações da proteína é ensaio fermento 2-híbrido (Y2H), que trabalha pela montagem de um fator de transcrição quimérico funcionamento uma vez que os dois domínios da proteína de interesse ligam para um outro¹. Uma tela típica de Y2H é realizada através da criação de uma população de levedura que abriga tanto uma biblioteca de plasmídeos codificação interação proteínas fundidas a um ativador transcricional (ex., ‘presas’ a proteína de fusão) e um determinado ‘isca’ plasmídeo composto da proteína de interesse fundido a um domínio de ligação do DNA (por exemplo, o domínio de Gal4 DNA-ligando que vincula-se à sequência de ativação Gal4-upstream). Uma das principais vantagens da abordagem Y2H é que é relativamente fácil e barata para realizar em um laboratório típico equipada para trabalho rotineiro de biológica molecular². No entanto, quando tradicionalmente realizada, um usuário amostras colônias individuais que surgem em seleção para uma interação positiva de Y2H. Isto limita severamente o número de clones ‘presas’ biblioteca que podem ser pesquisados. Este problema é agravado quando a abundância de uma particular interação presa é muito elevada em relação às outras, diminuindo a chance de detecção de interação de plasmídeos de rapina baixa abundância.

Uma solução para usando o princípio de Y2H em uma cobertura abrangente da proteoma é o uso de uma abordagem de matriz formatada no qual uma matriz contendo plasmídeos conhecido presas individuais pode ser interrogada digitalmente. No entanto, essa abordagem exige uma infra-estrutura que não é prontamente acessível ou rentável para os investigadores que estão interessados em definir a interactome de um pequeno número de proteínas ou domínios³. Além disso, bibliotecas de rapina muito complexo que podem codificar vários fragmentos de interação de proteínas que expandir o tamanho do como matrizes matriz para tamanhos impraticáveis. Uma alternativa é realizar ensaios com bibliotecas complexas em lotes e avaliar a presença de interação clones usando sequenciamento de elevado-throughput maciço paralelo⁴. Isto pode ser aplicado para ensaiar a presença de plasmídeos de rapina que surgem em várias colônias usando um típico Y2H formatado abordagem em qual fermento habitação um par de interação de proteínas da fusão de células podem crescer em uma placa de^5,6. Esta ideia geral pode ser acentuada para aumentar a consulta de ambos várias iscas e presas componentes ao mesmo tempo^7,8.

Ainda assim, muitas investigações exigem que um mais fácil ainda mais focado esforço em apenas algumas proteínas ‘iscas’ e podem se beneficiar mais de uma consulta exaustiva e semi-quantitativa de uma biblioteca de rapina complexo único. Temos desenvolvido e validado uma abordagem para realizar estudos de interação de proteínas em larga escala usando um princípio de Y2H em formato de lote⁴. Isto usa a taxa de expansão de um plasmídeo presa particular como um proxy para a força relativa da interação de Y2H⁹. Sequenciamento profundo de todos os plasmídeos dentro de uma população submetida ao crescimento normal ou condições de crescimento seletivo produz um mapa completo de clones que geram interações de Y2H forte e fracas. O repertório de interactianos pode ser obtido e comparado diretamente através de múltiplos isca plasmídeos. O fluxo de trabalho resultante denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteínas), portanto, pode ser usado para identificar interactomes diferencial das bibliotecas de rapina mesmo para identificar proteínas, permitindo a comparação entre uma proteína vs outro.

Aqui, demonstramos DEEPN e introduzir melhorias nos métodos laboratoriais que facilitam a sua utilização, que são descritos na Figura 1. Melhorias significativas incluem:

Geração de populações de presas fermento. Um dos principais requisitos de DEEPN está gerando populações de levedura com diferentes isca plasmídeos que têm a mesma distribuição das bibliotecas de rapina do plasmídeo. Populações de equivalente de linha de base da biblioteca do plasmídeo presa são essenciais para fazer comparações precisas entre o interactomes de iscas diferentes. Isto é melhor alcançado quando um plasmídeo de biblioteca já está alojado em uma população de levedura haploide e entrando um plasmídeo isco dado que a população é alcançado pelo acasalamento para produzir um diploides. Aqui, nós fornecemos um guia claro em como fazer tais populações usando bibliotecas comerciais alojadas em leveduras haploides. Embora não tenhamos encontrado métodos que geram um número elevado de diploides, a eficiência global de acasalamento destas cepas de leveduras contendo biblioteca comercial foi baixa. Portanto, nós construímos uma nova tensão que pode abrigar presas bibliotecas que rende muito mais diploides por reação de acasalamento.

Novo conjunto de isca plasmídeos. Muitos plasmídeos atuais que expressam proteínas da fusão ‘isca’ compostas da proteína de interesse e um domínio de ligação a DNA são baseados em 2µ, permitindo-lhes ampliar seu número de cópia. Este número de cópia pode ser bastante variável na população e levar a variabilidade na resposta transcricional de Y2H. Isto por sua vez poderia inclinar a capacidade de medir a força de uma interação de proteína dada baseada a resposta de crescimento das células de seleção. Isto pode ser parcialmente endereço usando um plasmídeo cópia baixa, alguns dos quais têm sido descritos anteriormente como o comercialmente disponível pDEST32¹⁰. Nós construímos um nova isca do plasmídeo (pTEF-GBD) que produz proteínas da fusão Gal4-DNA-ligando domínio dentro de um plasmídeo de cópia baixa baseada em Centrómero TRP1 carreg o gene de resistência de Kanr que também permite a clonagem de fragmentos de isca contra a corrente e a jusante do domínio Gal4 DNA-ligando.

Biblioteca de fragmento de novo high-density Y2H. Temos construído um plasmídeo novo para bibliotecas de rapina Y2H casa e usou para construir uma biblioteca de Y2H altamente complexa feita de distorcida aleatoriamente fragmentos de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae. Análise de sequência mostrou que esta biblioteca tinha mais 1 milhão de elementos diferentes, muito mais complexos do que descritas anteriormente fermento Y2H genômica plasmídeo bibliotecas¹¹. Com essa nova biblioteca, fomos capazes de mostrar que o fluxo de trabalho do DEEPN é robusto o suficiente para acomodar o complexas bibliotecas com muitos plasmídeos diferentes de uma forma que é confiável e reprodutível.

Protocol

1. preparação de mídia e placas Nota: Todas as placas precisam ser feitas, minimamente, 2 dias antes de iniciar o protocolo. Os meios de comunicação podem ser feitos em qualquer ponto. No entanto, a extrato a adenina levedura tamponado peptona dextrose (bYPDA) precisa ser feita no dia em que será usado. Alguns meios de comunicação é feito usando uma mistura de suplemento contendo um nível de adenina é maior do que o que normalmente é usado. A maioria dos suplementos de media mínimos…

Representative Results

O ensaio de Y2H tem sido amplamente utilizado para encontrar interações da proteína: proteína e várias adaptações e sistemas foram desenvolvidos. Na maior parte, as mesmas considerações que ajudam a garantir o sucesso com estas abordagens anteriores são importantes para DEEPN. Alguns dos pontos de referência importantes incluem: garantindo a expressão do domínio de ligação a DNA proteínas da fusão, garantindo um baixo fundo de espúrias + seu crescimento nos diploides que…

Discussion

Aqui nós fornecemos um guia de como realizar ensaios Y2H em lote usando métodos otimizados. Existem alguns passos críticos no procedimento para ajudar a garantir que a população de levedura que devem ser colocada sob seleção é representante da biblioteca de partida e que suficiente da população inicial de fermento é usado para se submeter a seleção para limitar a variabilidade . Importante, estes parâmetros são relativamente fáceis de alcançar ao lado de adaptar os métodos e materiais para um ensaio de …

Materials

Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain	Dr. Robert Piper Lab		MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100