단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Summary

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

Abstract

효 모 2 잡종 분석 결과 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 심사는 긴 효과적인 도구, 하지만 사용 크게 상호 작용 후보자의 라이브러리에서 풍성 하 게 매우 높은 선호도 인터의 발견에 제한 되었습니다. 전통적인 형식에서 효 모 2 잡종 분석 결과 분석 낮은 엄중에서 실시 하는 경우에 낮은 선호도 인터를 찾을 수 있습니다 너무 많은 식민지를 얻을 수 있습니다. 또한, 다른 미끼 플라스 미드에 대 한 동일한 라이브러리의 포괄적이 고 완전 한 심문 없이 비교 분석 얻을 수 없다. 이러한 문제 중 일부 기준점과 먹이 라이브러리를 사용 하 여 해결할 수 있습니다, 있지만 비용과 같은 화면을 작동 하는 데 필요한 인프라는 금지 될 수 있습니다. 대신, 우리 동시에 과도의 수십을 밝히기 위해 효 모 2 잡종 분석 결과 적응 및 정적 단백질 상호 작용 전략을 활용 한 화면 내에서 불리 DEEPN (평가의 단백질 네트워크를 위한 동적 농축)을 통합 높 처리량 DNA 연속 그리고 상호 작용 파트너 인코딩할 플라스 미드의 인구의 진화에 따라 계산 합니다. 여기, 우리 사용자 지정된 시 약 및 DEEPN 화면 쉽고 비용 효율적으로 실행 될 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

Introduction

세포 생물학 과정의 완전 한 이해를 찾는 그들의 분자 메커니즘의 기반이 되는 단백질 상호 작용 네트워크에 의존 합니다. 단백질 상호 작용을 식별 하는 한 가지 방법은 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과, 관심의 두 단백질 도메인 바인딩할 다른¹일단 작동 공상 전사 요소를 조립 하 여 작동 하는. 전형적인 Y2H 화면 인코딩 상호 작용 단백질에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 플라스 미드의 두 도서관 효의 인구를 생성 하 여 수행 됩니다 (예., ‘먹이’ 퓨전 단백질)와 주어진된 ‘미끼’ 플라스 미드 단백질의 구성 관심사의 DNA 바인딩 도메인 (예를 들면,에 Gal4 상류 활성화 순서 Gal4 DNA 바인딩 도메인)에 융합. Y2H 접근의 주요 장점 중 하나 그것은 상대적으로 쉽게 하 고 일상적인 분자 생물학 작업²에 대 한 일반적인 실험실에서 수행 하는 저렴 한 장비입니다. 그러나 때 전통적으로 수행, 사용자 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택 사항에 따라 발생 하는 개별 식민지를 샘플링 합니다. 이 심각 하 게 조사 될 수 있는 라이브러리 ‘먹이’ 클론의 수를 제한 합니다. 이 문제는 때 특정 상호 작용 먹이의 풍부한 매우 낮은 풍부한 먹이 플라스 미드에서 상호 작용 검출의 기회를 감소, 다른 기준으로 복합입니다.

Y2H 원리는 프로테옴의 포괄적인 범위에서 사용 하기 위한 하나의 솔루션 알려진된 개별 먹이 플라스 미드를 포함 하는 배열을 디지털 심문 될 수 있습니다 어떤 점에서 매트릭스 형식의 접근 방법의 사용 이다. 그러나, 이러한 접근 되지 않는 쉽게 액세스할 수 또는 비용 효율적인 단백질 또는 도메인³의 적은 수의 위하여 정의에 관심이 개별 조사 하는 인프라가 필요 합니다. 또한, 상호 작용 단백질의 여러 단편을 인코딩할 수 있습니다 매우 복잡 한 먹이 라이브러리 것 허무 크기 같은 매트릭스 배열의 크기를 확장 합니다. 대안은 배치에서 복잡 한 라이브러리와 분석을 수행 하 고 대규모 병렬 높 처리량 연속⁴를 사용 하 여 상호 작용 클론의 존재를 평가 하는 것 이다. 이 일반적인 사용 하 여 여러 식민지에서 발생 하는 먹이 플라스 미드의 존재를 시험에 적용할 수 있는 Y2H 형식의 접근을 효 모에 세포 융해 단백질의 상호 작용 쌍 주택 접시^5,6에 성장 수 있습니다. 이 일반적인 생각 쿼리 두 여러 미끼의 증가 먹이 같은 시간^7,8에서 구성 요소를 강조 될 수 있습니다.

아직도, 많은 조사 쉽게 아직 더에 초점을 맞춘 노력 불과 단백질 ‘미끼’를 요구 하 고 단일 복잡 한 먹이 라이브러리의 완전 및 반 정량적 쿼리에서 더 혜택을 받을 수 있습니다. 우리가 개발 하 고 배치 형식⁴의 Y2H 원리를 사용 하 여 대규모 단백질 상호 작용 연구를 수행 하는 방법을 확인 했습니다. 이 Y2H 상호 작용⁹의 상대 강도 대 한 프록시는 특정 먹이 플라스 미드의 확장 속도 사용합니다. 인구 내의 모든 플라스 미드의 깊은 시퀀싱 대상이 정상적인 성장 또는 선택적 성장 조건 강하고 약한 Y2H 상호 작용을 생성 하는 클론의 완전 한 지도 생성. 인터의 레 퍼 토리 얻을 하 고 직접 여러 미끼 플라스 미드에 걸쳐 비교 수 있습니다. 불리 DEEPN (동적 농축 단백질 네트워크의 평가) 결과 워크플로 따라서 다른에 대 한 단백질 사이 비교를 허용 하는 단백질을 식별 하기 위해 같은 먹이 라이브러리에서 차동 interactomes 식별 하 사용할 수 있습니다.

여기, 우리가 DEEPN 설명 그림 1에 설명 되어 있습니다 실험실 방법의 사용을 촉진 하는 개선 사항 소개. 중요 한 개선 다음과 같습니다.

먹이 효 모 인구의 세대. DEEPN의 주요 요구 사항 중 하나 다른 미끼 플라스 미드 플라스 미드 먹이 라이브러리의 동일한 분포와 누 룩의 생성 합니다. 등가 기준 인구 먹이 플라스 미드 도서관의 다른 미끼의 interactomes 간의 정확한 비교를 만들기 위한 필수적입니다. 이것은 최고의 도서관 플라스 미드는 이미 단일 효 모 인구에 자리 하 고는 2 중 생산 짝짓기에 의해 달성 된다 인구에 주어진된 미끼 플라스 미드 이동 달성. 여기, 우리는 단일 효 모에는 상용 라이브러리를 사용 하 여 이러한 인구를 확인 하는 방법에 명확한 가이드를 제공 합니다. 우리가 diploids의 높은 번호를 생성 하는 방법을 발견, 이러한 상용 라이브러리-포함 된 효 모 종자의 전반적인 짝짓기 효율 낮은 했다. 따라서, 우리는 짝짓기 반응 당 훨씬 더 많은 diploids 수율 먹이 라이브러리를 집을 수 있습니다 새로운 긴장을 건설 한다.

새로운 미끼 플라스 미드의 설정. 익스프레스 ‘미끼’ 퓨전 단백질 구성 관심과 DNA 바인딩 도메인의 단백질의 많은 현재 플라스 미드 2µ-기반으로, 그들의 복사본 수를 증폭 하는. 이 복사 번호 인구에서 매우 변수 하 고 Y2H transcriptional 응답에서 가변성으로 이어질 수 있습니다. 이 차례로 선택 셀의 성장 응답에 따라 주어진된 단백질 상호 작용의 강도 측정 하는 기능을 왜곡 수 있습니다. 이 중 일부는 이전 상용 pDEST32¹⁰같은 설명 되었습니다 낮은 사본 플라스 미드를 사용 하 여 주소 분할 수 있습니다. 우리가 건설 한 새로운 미끼 플라스 미드 (pTEF GBD) 또한 상류의 미끼 조각 모두 복제 수 있습니다 Kanr 저항 유전자를 운반 TRP1 centromere 기반 낮은 사본 플라스 미드 내 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질을 생산 하 고 Gal4 DNA 바인딩 도메인의 다운스트림.

새로운 고밀도 Y2H 조각 도서관. 우리 집 Y2H 먹이 라이브러리에 새로운 플라스 미드를 건설 하 고 게놈 DNA의 임의로 깎인된 파편의 Saccharomyces cerevisiae에서 만든 매우 복잡 한 Y2H 라이브러리를 구축 하는 데 사용. 시퀀스 분석이 라이브러리 1 백만 이상 다른 요소, 앞에서 설명한 효 모 게놈 Y2H 플라스 미드 도서관¹¹보다 훨씬 더 복잡 했다 보여주었다. 이 새로운 라이브러리 DEEPN 워크플로 안정적이 고 재현 가능한 방식으로 많은 다른 플라스 미드와 복잡 한 라이브러리에 맞게 충분히 강력한 보여줄 수 있었습니다.

Protocol

1입니다. 미디어와 접시의 준비 참고: 모든 접시 프로토콜을 시작 하기 전에 2 일 최소로 만들 필요가 있다. 미디어는 언제 든 지 할 수 있다. 그러나, 버퍼링 된 효 모 추출 물 펩 포도 당 아데닌 (bYPDA) 사용 되는 날을 만들 수 필요가 있다. 일부 미디어 무엇 일반적으로 사용 되는 보다 큰 아데닌의 수준을 포함 하는 보충 믹스를 사용 하 여 이루어집니다. 대부분 최소한의 미디어 …

Representative Results

Y2H 분석 결과 단백질: 단백질 상호 작용을 찾기위한 널리 사용 되었습니다 그리고 몇 가지 적응 및 시스템 개발 되었습니다. 대부분의 경우, 이러한 이전 접근의 성공을 보장 하는 데 도움이 같은 고려 DEEPN에 대 한 중요 하다. 중요 한 벤치 마크의 일부를 포함: 보장 표현의 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질, 보장의 스 퓨 리 어스 낮은 배경을 포함 하는 빈 먹이 플라스 미드, ?…

Discussion

여기 우리는 최적화 된 방법을 사용 하 여 일괄 처리에서 Y2H 분석 실험을 수행 하는 방법에 대 한 가이드를 제공 합니다. 선택 아래에 배치 될 것 이다 효 모의 인구 시작 라이브러리의 대표는 하 고 충분히 시작 효 모 인구 다양성을 제한 하는 선택을 사용 하는 절차에 있는 몇 가지 중요 한 단계 . 중요 한 것은, 이러한 벤치 마크는 적응 방법 및 전통적인 Y2H 분석 결과, 따라서이 방법은 대부분 실?…

Materials

Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain	Dr. Robert Piper Lab		MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100