Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Summary

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Abstract

Screening voor eiwit-eiwitinteractie met behulp van de gist 2-hybrid test is al lang een effectief instrument, maar het gebruik ervan grotendeels beperkt gebleven tot de ontdekking van hoge-affiniteit interactors die in de bibliotheek van interagerende kandidaten zijn hoogverrijkt. In een traditionele indeling, kan de gist 2-hybrid assay opleveren teveel kolonies om te analyseren wanneer uitgevoerd bij lage striktheid waar lage affiniteit interactors kunnen worden gevonden. Bovendien, zonder een uitgebreide en volledige ondervraging van dezelfde bibliotheek tegen verschillende aas plasmiden, een vergelijkende analyse niet worden bereikt. Hoewel sommige van deze problemen kunnen worden opgelost met behulp van gekleed prooi Bibliotheken, kunnen de kosten en de infrastructuur die nodig is om dergelijke schermen onbetaalbaar. Als alternatief hebben we aangepast de gist 2-hybrid bepaling om tegelijkertijd tientallen van voorbijgaande aard bloot te leggen en statische eiwitinteractie binnen één scherm met behulp van een strategie genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de proteïne), die omvat high-throughput DNA sequencing en berekening de ontwikkeling van een populatie van plasmiden, die coderen van interagerende partners te volgen. Hier beschrijven we aangepaste reagentia en protocollen waarmee een DEEPN scherm op eenvoudige en lonende wijze worden uitgevoerd.

Introduction

Een volledig inzicht in biologische processen van de cel is afhankelijk van het vinden van de Eiwit-interactienetwerken die ten grondslag liggen aan hun moleculaire mechanismen. Een benadering te identificeren eiwitinteractie is de gist 2-hybrid assay (Y2H), die werkt door het monteren van een goed functionerende chimeer transcriptiefactor zodra twee domeinen van de proteïne van belang aan elkaar^{1 binden}. Een typische Y2H scherm wordt uitgevoerd door het creëren van een bevolking van gist dat huizen van beide een bibliotheek van plasmiden, interacterende eiwitten, gesmolten tot een transcriptionele activator codering (bv., ‘prooi’ fusieproteïne) en een bepaalde ‘lokaas’ plasmide bestaat uit het eiwit gesmolten tot een DNA-bindende-domein (bijvoorbeeld, de Gal4 DNA-bindend domein dat zich aan de Gal4-upstream activerend volgorde bindt) van belang. Een van de belangrijkste voordelen van de Y2H-aanpak is dat het is relatief eenvoudig en goedkoop uit te voeren in een typische laboratorium voor moleculaire biologische routinewerk^{2 uitgerust}. Echter als traditioneel uitgevoerd, monsters een gebruiker afzonderlijke kolonies die zich bij de selectie voor een positieve interactie met de Y2H voordoen. Dit beperkt ernstig het aantal bibliotheek ‘prooi’ klonen die kunnen worden onderzocht. Dit probleem wordt nog verergerd wanneer de overvloed aan een bepaalde interactie prooi zeer hoog ten opzichte van de anderen is, het afnemen van de kans op interactie van lage overvloed prooi plasmiden opsporen.

Een oplossing voor het gebruik van het Y2H-beginsel in de uitgebreide dekking van de Proteoom is het gebruik van een matrix-indeling aanpak waarin een array met daarin bekende individuele prooi plasmiden digitaal kan worden ondervraagd. Een dergelijke benadering vereist echter een infrastructuur die niet gemakkelijk toegankelijk te laten of kosteneffectieve aan individuele onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het definiëren van de interactome van een klein aantal proteïnen of domeinen³. Bovendien zou zeer complexe prooi bibliotheken die meerdere fragmenten van interacterende eiwitten kunnen coderen de grootte van deze matrix arrays uitbreiden naar onpraktisch maten. Een alternatief is het uitvoeren van testen met complexe bibliotheken in batches en beoordelen van de aanwezigheid van interagerende klonen met massale parallelle high-throughput sequencing⁴. Dit kan worden toegepast om de test op de aanwezigheid van plasmiden met prooi, die zich voordoen in meerdere kolonies met behulp van een typische Y2H opgemaakt aanpak in welke gist cellen huisvesting een interactie paar fusion eiwitten zijn toegestaan om te groeien op een plaat^5,6. Dit algemene idee kan worden geaccentueerd ter vergroting van de query van beide meerdere aas en prooi onderdelen op de dezelfde tijd^7,8.

Toch veel onderzoeken vereisen dat een gemakkelijker nog meer gericht inspanning op slechts een paar eiwit ‘lokaas’ en meer kunnen profiteren door een uitputtende en semi-kwantitatieve-query van een enkele complexe prooi-bibliotheek. Wij hebben ontwikkeld en gevalideerd van een aanpak voor het uitvoeren van grootschalige eiwit interactie studies gebruik te maken van een Y2H principe in batch formaat⁴. Deze maakt gebruik van het tempo van de expansie van een specifieke prooi plasmide als een proxy voor de relatieve sterkte van Y2H interactie⁹. Diepe sequentiebepaling van alle plasmiden binnen een populatie onderworpen aan normale groei of selectieve groei omstandigheden produceert een volledige kaart van klonen dat de opbrengst van de sterke en zwakke Y2H interacties. Het repertoire van interactors kan worden verkregen en rechtstreeks met elkaar vergeleken in meerdere aas plasmiden. De resulterende workflow genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de eiwitten) kan dus worden gebruikt om te identificeren van differentiële interactomes uit de dezelfde prooi bibliotheken te identificeren van eiwitten, waardoor vergelijking tussen één eiwit vs. andere.

Hier tonen we DEEPN en verbeteringen in de laboratoriumtechnieken die vergemakkelijken het gebruik ervan, die worden beschreven in Figuur 1. Belangrijke verbeteringen zijn onder andere:

Generatie van prooi gist bevolking. Een van de belangrijkste vereisten van DEEPN is het genereren van populaties van gist met verschillende aas plasmiden die de dezelfde verdeling van de plasmide prooi bibliotheken hebben. Gelijkwaardige basislijn populaties van de prooi plasmide bibliotheek zijn essentieel voor hetgeen een exacte vergelijking tussen de interactomes van verschillende lokaas. Dit gebeurt best bij een plasmide bibliotheek al is gehuisvest in een haploïde gist bevolking en een bepaalde aas plasmide betreden die bevolking wordt bereikt door de paring voor de productie van een diploïde. Wij bieden hier een duidelijke handleiding in hoe te maken van dergelijke populaties commerciële bibliotheken gehuisvest in haploïde gist gebruiken. Hoewel we vonden de methoden die het genereren van een groot aantal ze, was de paring totaalrendement van deze commerciële bibliotheek-bevattende giststammen laag. Dus we hebben gebouwd een nieuwe spanning die kan huis prooi bibliotheken die veel meer ze per paring reactie oplevert.

New set van aas plasmiden. Veel huidige plasmiden die uitdrukking geven aan ‘lokaas’ fusion eiwitten bestaat van de proteïne van belang en een DNA-bindende domein zijn 2µ gebaseerde, waardoor ze hun exemplaaraantal versterken. Deze exemplaaraantal kan heel variabel in de bevolking en leiden tot variabiliteit in het Y2H transcriptionele antwoord. Dit kan op zijn beurt de mogelijkheid om te meten de sterkte van een bepaald eiwit interactie op basis van de reactie van de groei van cellen onder selectie scheeftrekken. Dit kan gedeeltelijk adres met behulp van een laag kopie plasmide, waarvan sommige eerder zoals de verkrijgbare pDEST32^{10 beschreven zijn}. We hebben een nieuwe aas plasmide (pTEF-GBD) die produceert Gal4-DNA-bindende domein fusion eiwitten binnen een TRP1 laag kopie centromeer gebaseerde plasmide uitvoering van het Kanr-resistentie gen waarmee ook klonen van aas fragmenten, zowel stroomopwaarts gebouwd en stroomafwaarts van het domein van Gal4 DNA-bindende.

Nieuwe High-Density Y2H fragment library. We gebouwd een nieuwe plasmide naar huis Y2H prooi bibliotheken en gebruikt het om te bouwen van een uiterst complexe Y2H bibliotheek gemaakt van willekeurig sheared fragmenten van genomic DNA van Saccharomyces cerevisiae. Sequentieanalyse toonde aan dat deze bibliotheek had meer dan 1 miljoen verschillende elementen, veel complexer dan hierboven beschreven gist genomische Y2H plasmide bibliotheken¹¹. Met deze nieuwe bibliotheek waren we kunnen laten zien dat het DEEPN werkstroom robuust genoeg is voor complexe bibliotheken met vele verschillende plasmiden op een wijze die betrouwbaar en reproduceerbaar is.

Protocol

1. voorbereiding van de Media en platen Opmerking: Alle platen moeten minimaal 2 dagen voor het begin van het protocol worden gemaakt. De media kan worden gemaakt op elk gewenst moment. De gebufferde gist extract pepton dextrose adenine (bYPDA) moet echter geschieden op de dag die zal worden gebruikt. Sommige media wordt gemaakt met behulp van een supplement mix, met een level van adenine dat groter is dan wat wordt meestal gebruikt. Meeste minimale media supplementen geven 10 mg/L adenine. Supp…

Representative Results

De Y2H bepaling is wijd verbeid gebruikt voor het vinden van eiwit: eiwitinteractie en diverse aanpassingen en systemen zijn ontwikkeld. Voor het grootste deel, zijn dezelfde overwegingen die helpen zorgen voor succes met deze vorige benaderingen belangrijk voor DEEPN. Enkele van de belangrijke ijkpunten zijn: zorgen voor expressie van DNA-bindende domein fusie-eiwitten, zorgen voor een lage achtergrond van vals zijn + groei in de ze met het aas van belang met een lege prooi plasmide, een…

Discussion

Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van de Y2H tests in batch met behulp van geoptimaliseerde methoden. Er zijn een paar kritische stappen in de procedure om ervoor te zorgen dat de bevolking van gist die zou worden geplaatst onder selectie representatief voor de startende bibliotheek is en dat genoeg van de startende gist bevolking wordt gebruikt voor het ondergaan van de selectie te beperken variabiliteit . Nog belangrijker is, is deze benchmarks zijn relatief gemakkelijk te bereiken naast de aanpassing van de m…

Materials

Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain	Dr. Robert Piper Lab		MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100