Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина
Summary
Пакетная обработка экранов 2-гибрида дрождей позволяет для прямого сравнения профилей взаимодействия нескольких приманки белков с весьма сложным набором добычу синтеза белков. Здесь мы описываем, изысканные методы, новые реагенты и как осуществлять их использования для таких экранов.
Abstract
Скрининг для взаимодействий протеин протеина используя пробирного 2-гибрида дрождей уже давно эффективным средством, но его использование во многом был ограниченным к открытию высокоспецифичные посредники, которые сильно обогащенный в библиотеке взаимодействующих кандидатов. В традиционном формате пробирного 2-гибрида дрождей может принести слишком много колоний для анализа при проведении в низкой жесткости где низкого сродства посредники могут быть найдены. Кроме того без всеобъемлющей и полной допроса той же библиотеки против различных приманки плазмид, сравнительный анализ невозможно. Хотя некоторые из этих проблем могут быть решены с использованием библиотек выстроились добычу, стоимость и инфраструктуры, необходимых для работы таких экранов может быть непомерно высока. В качестве альтернативы, мы адаптировали дрожжи 2-гибрид assay одновременно раскрыть десятки переходных и статические белковых взаимодействий в одном экране, используя стратегию называют DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей), который включает в себя высокопроизводительного секвенирования ДНК и вычисление проследить эволюцию популяции плазмиды, которые кодируют взаимодействия партнеров. Здесь мы описываем заказной реагентов и протоколы, которые позволяют DEEPN экрана, чтобы быть выполнен легко и экономически эффективно.
Introduction
Полное понимание биологических процессов клетки основывается на поиске сетей взаимодействия белков, которые лежат в основе их молекулярные механизмы. Один из подходов к идентификации взаимодействий протеина является дрожжи assay (Y2H) 2-гибрид, который работает путем сборки функционирования химерных транскрипционный фактор, после двух доменов протеина интереса связывать друг с другом1. Типичный Y2H экран осуществляется путем создания население дрожжей, что дома обе библиотеки плазмид кодирования взаимодействуя белками, сливается с transcriptional активатор (например., «добычу» синтез белка) и плазмида данного «приманки» состоит из белка из интереса сливается с ДНК связывающий домен (например, Gal4 ДНК-связывающих домен, который связывает вверх по течению Gal4 активируя последовательности). Одним из главных преимуществ Y2H подход является, что это сравнительно легко и недорого провести в типичной лаборатории оснащены для рутинной молекулярных биологических работы2. Однако когда традиционно выполняется, пользователь образцы отдельных колоний, которые возникают при выборе для позитивного взаимодействия Y2H. Это серьезно ограничивает количество библиотека «добычу» клоны, которые могут быть обследованы. Эта проблема усугубляется, когда обилие конкретных взаимодействующих добычу очень высока по сравнению с другими, уменьшая вероятность обнаружения взаимодействия с низкой численности хищных плазмид.
Одним из решений для использования Y2H принципа всеобъемлющего охвата протеома является использование матрицы формате подхода, которой массив плазмид известных индивидуальных добычу могут допрашиваться цифровой. Однако такой подход требует инфраструктуры, которая не является легко доступной или экономически отдельных следователей, которые заинтересованы в определении interactome небольшое количество белков или домены3. Кроме того очень сложные добычу библиотек, которые могут кодировать несколько фрагментов взаимодействующих белков будет расширять размер такой матрицы массивов непрактичным размеров. Альтернативой является для выполнения анализов с комплекс библиотек в пакетах и оценить наличие взаимодействующих клонов, используя массивной параллельной последовательности высок объём4. Это может быть применено к assay присутствие плазмид добычу, которые возникают в несколько колоний, с использованием типичного Y2H формате подход, в котором дрожжи клетки жилья взаимодействующие синтеза белков могут расти на пластине5,6. Эта общая идея может акцентировал увеличить запрос оба несколько приманки и добычей компонентов на же время7,8.
Тем не менее многие расследования требуют что проще еще более целенаправленный характер усилий на нескольких белка «приманки» и может принести пользу более запросом исчерпывающим и полуколичественных единый комплекс добычу библиотеки. Мы разработали и проверены подход для выполнения белка широкомасштабного взаимодействия исследования с использованием Y2H принцип в пакетный формат4. Скорость расширения конкретной жертвой плазмида использует в качестве прокси для относительной силы взаимодействия Y2H9. Глубокие секвенирования всех плазмид в рамках населения подвергается нормальному росту или селективный рост условий производит полную карту клонов, которые дают сильные и слабые Y2H взаимодействий. Репертуар посредники могут получить и непосредственно сравнивать по несколько плазмидов приманки. Полученный рабочий процесс, называется DEEPN (динамический обогащения для оценки белка сетей) таким образом может использоваться для определения дифференциального interactomes же добычей библиотек для идентификации белков, позволяя сравнение одного белка против другой.
Здесь, мы демонстрируем DEEPN и внесения улучшений в лабораторных методов, которые облегчают его использования, которые приводятся на рисунке 1. Значительные усовершенствования включают в себя:
Поколение популяций хищных дрожжи. Одним из ключевых требований DEEPN порождает населения дрожжей с различные приманки плазмиды, которые имеют такое же распределение библиотек добычу плазмиды. Эквивалентные базовых популяций хищных плазмида библиотеки необходимы для точных сопоставлений между interactomes разных приманки. Это лучше всего достигается, когда библиотека плазмида уже расположен в haploid дрожжей населения и перемещение заданного приманки плазмида в населения достигается путем спаривания производить диплоидные. Здесь мы предоставляем четкое руководство в том, как сделать такое население, с использованием коммерческих библиотек, размещенный в haploid дрожжей. Хотя мы нашли методы, которые генерируют большое количество diploids, общей спаривания эффективности эти коммерческие библиотеки, содержащей штаммов дрожжей был низким. Таким образом мы построили новый штамм, который может дом добычу библиотек, что дает гораздо больше diploids за спаривания реакции.
Новый набор приманки плазмид. Многие текущие плазмиды, которые выражают протеины сплавливания «приманки» входят протеина интереса и ДНК связывающих домена на основе 2μ, позволяя им для того усилить их копии номер. Этот номер копии могут быть вполне переменной в населенности и привести к изменчивости в ответ transcriptional Y2H. Это в свою очередь может исказить возможность оценить силу взаимодействия данного белка, основываясь на ответе роста клеток под выбор. Это может быть частично адрес с помощью низкой копировать плазмиду, некоторые из которых ранее были описаны как коммерчески доступных pDEST3210. Мы построили новые приманки плазмида (pTEF ГПБ), которая производит Gal4-ДНК связывающих белков фьюжн домена внутри центромер низкая копирования плазмида TRP1 , перевозящих ген сопротивления Kanr, также позволяет клонирования приманки фрагментов оба вверх по течению и вниз по течению от Gal4 ДНК-связывающих домена.
Библиотека фрагмент новой высокоплотного Y2H. Мы построен новый плазмида дом Y2H добычу библиотек и использовал его для построения сложных Y2H библиотеки из случайно стриженый фрагментов геномной ДНК из Saccharomyces cerevisiae. Анализ последовательности показали, что эта библиотека более 1 миллиона различных элементов, гораздо более сложным, чем ранее описанные дрожжи геномной Y2H плазмиды библиотек11. С этой новой библиотеки мы смогли показать, что процесс DEEPN достаточно прочным для того, чтобы вместить комплекс библиотек с много различных плазмид в манере, которая является надежным и воспроизводимость.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем руководство по как для выполнения анализов Y2H в пакете с помощью оптимизированные методы. Есть несколько критических шаги процедуры, чтобы помочь обеспечить население дрожжей, который будет находиться в разделе выбор представителя начала библиотеки и что доста?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников в рамках Института генетики человека для подготовки NGS библиотеки и последовательности. Мы благодарим Эйнат Снир за ее опыт в подготовке геномная библиотека фрагментов для библиотеки плазмида Y2H здесь. Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения: низ R21 EB021870-01A1 и NSF исследовательский проект Грант: 1517110.
Materials
| Illumina HiSeq 4000 | Illumina | deep sequencing platform | |
| Monoclonal anti-HA antibodies | Biolegend | 901514 | Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs |
| Polyclonal anti-myc antibodies | QED Biosciences Inc | 18826 | Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs |
| NarI | New England BioLabs | R0191S | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3236S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| Polyethylene Glycol 3350, powder | J.T. Baker | U2211-08 | |
| Salmon Sperm DNA | Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific | 50-948-286 | carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1. |
| Kanamycin Monosulfate | Research Products International | K22000 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | used for making DNA agarose gels |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23025 | |
| Tryptone | Research Products International | T60060 | |
| D-Sorbitol | Research Products International | S23080 | |
| Lithium Acetate Dihydrate | MP Biomedicals | 155256 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher | C79 | |
| EDTA Sodium Salt | Research Products International | E57020 | |
| Yeast Extract Powder | Research Products International | Y20020 | |
| Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids | Research Products International | Y20040 | |
| CSM-Trp-Leu+40ADE | Formedium | DCS0789 | |
| CSM-Trp-Leu-His+40ADE | Formedium | DCS1169 | |
| CSM-Leu-Met | Formedium | DCS0549 | |
| CSM-Trp-Met | Bio 101, Inc | 4520-922 | |
| L-Methionine | Formedium | DOC0168 | |
| Adenine | Research Products International | A11500 | |
| D-(+)-Glucose | Research Products International | G32045 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | used for making media plates in section 1 |
| Peptone | Research Products International | P20240 | |
| 3-amino-1,2,4 Triazole | Sigma | A8056 | |
| 2-Mercaptoehanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Zymolyase 100T | USBiological | Z1004 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | P8281 | |
| Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9732 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 238074 | |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC | 2716 | |
| RNAse A | ThermoFisher | EN0531 | |
| Urea | Research Products International | U20200 | |
| SDS | Research Products International | L22010 | |
| glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Tris-HCl | Gibco | 15506-017 | |
| bromophenol blue | Amresco | 449 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510S | Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2 |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541S | Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1 |
| Ethidium Bromide | Amresco | 0492-5G | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Used for purification of pcr products in section 6.2.3 |
| Qiaquick DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1 |
| KAPA Hyper Prep kit | KAPA Biosystems | KK8500 | preparation kit for deep sequencing |
| Codon optimization | http://www.jcat.de | ||
| Codon optimization | https://www.idtdna.com/CodonOpt | ||
| gBlocks | Integrated DNA Technologies | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
| Strings | Thermofisher | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
| GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit | EPOCH Life Sciences | Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3 | |
| Covaris E220 | Covaris | high performance ultra-sonicator in section 7 | |
| oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
| oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
| oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
| oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
| PJ69-4A MatA yeast strain | http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 | MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7 | |
| pTEF-GBD | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-DNA binding doimain expression plasmid | |
| PLY5725 MATalpha yeast strain | Dr. Robert Piper Lab | MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆ | |
| pGal4AD (pPL6343) | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-activation domain expression plasmid | |
| 100 mm petri dishes | Kord-Vallmark sold by VWR | 2900 | |
| 125 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63270 | |
| 250 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
| 1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
| 2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63275 | |
| 20 X 150 mm Disposable Culture Tube | Thermofisher | 14-961-33 | |
| pipet-aid | Drummond | 4-000-100 | |
| 5 mL Serological Pipette | Denville | P7127 | |
| 10 mL Serological Pipette | Denville | P7128 | |
| 25 mL Serological Pipette | Denville | P7129 | |
| 1,000 mL PYREX Griffin Beaker | Fisher Scientific | 02-540P | |
| 1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
| 1,000 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6G | |
| SpectraMax 190 | Molecular Devices | used to measure the Optical Density of cells | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Spectrophotometer used to quantify amount of DNA |
| Electronic UV transilluminator | Ultra Lum | MEB 20 | used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel |
| P1000 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123602G | |
| P200 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123601G | |
| P20 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123600G | |
| P10 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F144802G | |
| 1250 µL Low Retention Pipette Tips | GeneMate | P-1236-1250 | |
| 200 µLLow Retention Pipette Tips | VWR | 10017-044 | |
| 10 µL XL Low Retention Pipette Tips | VWR | 10017-042 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 490001-627 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 490001-621 | |
| cell scraper | Denville Scientific | TC9310 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| HCl | Fluka Analytical | 318949-1L | |
| NaOH | J.T. Baker | 5674-02 | |
| Wooden applicators | Solon Care | 55900 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424 | Fisher Scientific | 05-400-005 | microcentrifuge |
| Sorvall ST16R | Thermo Fisher Scientific | 75004381 | benchtop centrifuge |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare | NA934-1ML | Secondary Antibody |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Secondary Antibody |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | ECL detection solution |
| Isotemp Incubator | Thermo Fisher Scientific | Incubator | |
| Mutitron 2 | INFORS HT | Shaking incubator | |
| Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 | Fisher Scientific | water bath | |
| Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) | Clontech | 630482 | commercially available cDNA Library |
| Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) | Clontech | 630488 | commercially available cDNA Library |
| pGADT7 AD Vector | Clontech | 630442 | commercially available AD Vector housing many cDNA libraries |
| pGBKT7 DNA-BD Vector | Clontech | 630443 | commercially available DNA-BD Vector |
| Biolase DNA Polymerase | Bioline | BIO-21042 | DNA polymerase used for section 2.4 |
| GeneMate GCL-60 Thermal Cycler | BioExpress | P-6050-60 | pcr machine |
| TempAssure 0.5 mL PCR tubes | USA Scientific | 1405-8100 |
Referências
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
- Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
- Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
- Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
- Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
- Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
- Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
- Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
- James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genética. 144 (4), 1425-1436 (1996).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
- Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).
