פיתחנו מודל סרטן השד הטרוגנית המורכבת מונצחים הגידול פיברובלסט ותאי נעוץ bioink alginate/ג’לטין bioprintable. המודל recapitulates microenvironment הגידול ויוו ואסטמה ומקילה על היווצרות הגידול multicellular spheroids, מניבים תובנות מנגנוני נהיגה tumorigenesis.
הטרוגניות הסלולר הביוכימי, ביופיזיקלי של microenvironment הגידול הטבעית לא recapitulated על ידי גדל שורות תאים של סרטן מונצחים, באמצעות תרבית תאים (2D) דו מימדי קונבנציונלי. האתגרים הללו ניתן להתגבר על ידי שימוש בטכניקות bioprinting לבנות מודלים הטרוגנית הגידול תלת מימדי (3D) לפיה מוטבעים סוגים שונים של תאים. קילוף פלסטיצידיות ואת הג’לטין הם שני biomaterials הנפוץ ביותר המועסקים bioprinting שלהם הביו, ביומימטיקה וכתוצאה תכונות מכניות. על ידי שילוב של שני פולימרים, השגנו הידרוג ללא הפרדות צבע של bioprintable עם דמיון לאדריכלות מיקרוסקופיים של משתית הגידול הטבעית. למד את שמשטחו של הידרוג ללא הפרדות צבע באמצעות rheology ואנו שהושג חלון ההדפסה האופטימלי. תאים סרטניים בשד ו fibroblasts היו שמוטבע על hydrogels, מודפס כדי ליצור דגם תלת-ממד מחקה את microenvironment ויוו . המודל הטרוגניות bioprinted משיגה את הכדאיות גבוהה לתרבות תא לטווח ארוך (> 30 ימים) ומקדם הרכבה עצמית של תאים סרטניים בשד לתוך הגידול multicellular spheroids (MCTS). הבחנו את ההעברה ואת האינטראקציה של תאי פיברובלסט הקשורים לסרטן (CAFs) עם MCTS במודל זה. על ידי שימוש bioprinted תא תרבות פלטפורמות כמערכות תרבות משותפת, הוא מציע כלי ייחודי כדי ללמוד את התלות של tumorigenesis הרכב משתית. טכניקה זו כולל תפוקה גבוהה, בעלות נמוכה, וגבוה הפארמצבטית, זה יכול גם לספק מודל אלטרנטיבי לתרבויות טפט תא קונבנציונאלי ומודלים גידול בעלי חיים כדי ללמוד ביולוגיה סרטן.
למרות תרבית תאים 2D נעשה שימוש נרחב לחקר הסרטן, מגבלות קיימות כמו התאים גדלים בתבנית חד שכבתי עם ריכוז אחיד של חומרים מזינים וחמצן. תרבויות אלה חוסר תא חשוב-תא, התא-מטריקס אינטראקציות להציג הגידול מקורי microenvironment (טיים). כתוצאה מכך, מודלים אלה לקוי מסכם את הדברים בתנאים פיזיולוגיים, וכתוצאה מכך התנהגויות תא סוטה, לרבות מורפולוגיות לא טבעי, הארגון קולטן לא סדיר, ממברנה קיטוב ביטוי גנים לא נורמלי, בין היתר תנאים1,2,3,4. מצד שני, תרבית תאים תלת-ממד, שבו תאים מורחבים בחלל הנפחי אגרגטים, spheroids או organoids, מציעה טכניקה חלופית ליצירת מדויקת יותר במבחנה סביבות ללמוד יסוד התא ופיזיולוגיה. מודלים תרבות תלת התא יכול גם לעודד אינטראקציות סלולרי-ECM כי הם קריטיים הפיזיולוגיות של יליד טיים במבחנה1,4,5. הטכנולוגיה 3D bioprinting המתעוררים מספק אפשרויות לבנות מודלים המחקים את טיים הטרוגנית.
Bioprinting תלת-ממד נגזרת שטנץ מהירה ומאפשרת הזיוף של תלת-ממד מזערים המסוגלים לחקות חלק המורכבות של החיים דגימות רקמה6,7. השיטות bioprinting הנוכחי כוללים דיו, שחול הדפסת לייזר בסיוע8. ביניהם, מאפשרת השיטה ההבלטה של הטרוגניות להיות בשליטת בתוך מטריצות מודפס דווקא מיקום סוגים שונים של חומרים במקומות שונים ראשונית. לכן הגישה הטובה ביותר ליצור הטרוגניות במבחנה מודלים המערבים מספר סוגים של תאים או מטריצות. שחול bioprinting שימש בהצלחה כדי לבנות פיגומים בצורת אוריקולארית9,11,10,מבנים כלי דם12, ועור רקמות13, וכתוצאה מכך באיכות הדפסה גבוהה תא הכדאיות. הטכנולוגיה כולל גם בחירות חומרים מגוונים, היכולת להפקיד חומרים עם תאים מוטבע עם צפיפות ידוע וחדר הפארמצבטית גבוהה14,15,16,17 . Hydrogels טבעיים וסינתטיים משמשים לעתים קרובות כמו bioinks 3D bioprinting עקב הביו שלהם, אתריים ורשתות הידרופילית שלהם זה ניתן לתכנן להידמות מבנית ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogels גם הם יתרון כיוון שהם יכולים לכלול אתרים דבק עבור תאים, אלמנטים מבניים, חדירות של חומרים מזינים וגזים, התכונות המכאניות המתאים כדי לעודד תא פיתוח24. למשל, קולגן hydrogels מציעים אינטגרין אתרי anchorage תאים יכולים להשתמש בו כדי לצרף המטריקס. ג’לטין, שפגע בסימני קולגן, שומר על אתרים דומים של הידבקות תאים. לעומת זאת, alginate bioinert אך מספק תקינות מכנית על ידי יצירת crosslinks עם יונים כלט25,26,27,28.
בעבודה זאת, פיתחנו של הידרוג ללא הפרדות צבע כמו bioink, המורכב alginate, ג’לטין, עם קווי דמיון לאדריכלות מיקרוסקופיים של משתית הגידול הטבעית. תאים סרטניים בשד fibroblasts הוטבעו ב hydrogels, מודפס באמצעות bioprinter מבוססות ההבלטה ליצירת דגם תלת-ממד המחקה את microenvironment ויוו . בסביבת 3D מהונדסים מאפשר לתאים סרטניים בצורת הגידול multicellular spheroids (MCTS) עם הכדאיות גבוהה לתקופות ארוכות תרבית תאים (> 30 ימים). פרוטוקול זה מדגים את מתודולוגיות של סינתזה hydrogels ללא הפרדות צבע, אפיון של החומרים מיקרו ו שמשטחו, bioprinting דגמי הסלולר הטרוגנית, התבוננות היווצרות MCTS. מתודולוגיות אלה ניתן להחיל על אחרים bioinks ב שחול bioprinting כמו גם באשר עיצובים שונים של רקמות הטרוגנית מודלים עם יישומים פוטנציאליים והתרופות הקרנה תא העברת מבחני, מחקרים התמקד תא בסיסי פונקציות פיזיולוגיים.
יכול להיות בסכנה עמוסי תא מבנים אם זיהום (כימי או ביולוגי) מתרחשת בשלב כלשהו בתהליך. בדרך כלל, המתפללים נתפס לאחר שניים או שלושה ימים של תרבות כצבע שינוי תרבות המדיה או המבנה bioprinted. לכן, העיקור (חיטוי הפיסיקליות והכימיות) היא צעד מפתח עבור כל התהליכים הקשורים לתא. ראוי לציין, ג’לטין autoclaving משנ…
The authors have nothing to disclose.
ג’יאנג טאו תודה את סין מלגת מועצה (201403170354) ואת פרס דוקטורט להנדסה מקגיל (90025) למימון מלגות שלהם. יוסי ג’י Munguia-לופז תודה CONACYT (250279, 290936 ו- 291168), FRQNT (258421) למימון מלגות שלהם. סלבדור פלורס-טורס תודה CONACYT על המלגה שלהם מימון (751540). יוסף מ’ קינסלה תודה המדע הלאומי, מועצת המחקר ההנדסי, קרן קנדי על חדשנות, קרן משפחת טאונסנד-Lamarre ו אוניברסיטת מקגיל למימון שלהם. ברצוננו להודות אלן Ehrlicher ומאפשר לנו להשתמש rheometer שלו, דן Nicolau עבור ומאפשר לנו להשתמש מיקרוסקופ קונפוקלי שלו, ואת פארק מורג להענקת לנו גישה אל שורות תאים עם תוויות fluorescently.
Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
MilliQ water | Millipore | N/A | |
Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
Water bath | VWR | N/A | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |