Bioprintable Альгинатные/желатин гидрогеля 3D в Vitro модель системы вызывать клетки сфероида образование
Summary
Мы разработали гетерогенных груди Рак модель, состоящая из увековечен опухоли и фибробластов клетки, встроенный в bioprintable bioink Альгинатные/желатина. Эта модель резюмирует микроокружения опухоли в естественных условиях и облегчает формирование многоклеточного опухоли сфероидов, давая понять механизмы вождения tumorigenesis.
Abstract
Сотовые, биохимические и биофизические неоднородность микроокружения опухоли родной не сведены воедино растущего увековечен рак клеточных линий, с помощью обычных двухмерных (2D) клеточной культуры. Эти проблемы могут быть преодолены с помощью методов подложке для построения моделей гетерогенных трехмерные (3D) опухоли, whereby внедряются различные типы клеток. Альгинат и желатин являются двумя наиболее распространенными биоматериалов, занятых в подложке из-за их биосовместимости, biomimicry и механических свойств. Путем объединения двух полимеров, мы достигли bioprintable композитный гидрогеля с сходства в микроскопических архитектуру родной опухоли стромы. Мы изучили печатными свойствами композиционных гидрогеля через реологии и получено оптимальное окно печати. Клеток рака молочной железы фибробластов встроенных в гидрогелей и были напечатаны для формирования 3D-модель имитирует микроокружения в естественных условиях . Bioprinted гетерогенных модель достигает высокой жизнеспособности для долгосрочного клеточной культуры (> 30 дней) и способствует самостоятельной сборки из клеток рака молочной железы в многоклеточных опухоли сфероидов (MCTS). Мы наблюдали, миграции и взаимодействия клеток рака связанные фибробластов (CAFs) с MCTS в этой модели. С помощью bioprinted клетки культуры платформ как сопредседатель культуры системы, он предлагает уникальный инструмент для изучения зависимости tumorigenesis состав стромы. Эта техника имеет высокой пропускной способностью, низкая стоимость и высокая воспроизводимость, и она может также предоставлять альтернативную модель для обычных клетки однослойная культур и животных опухоли модели для изучения биологии рака.
Introduction
Хотя 2D клеточной культуры широко используется в исследовании рака, существуют ограничения, как клетки выращивают в формате монослой с единообразные концентрации питательных веществ и кислорода. Эти культуры не хватает важных клеток и клеток матрица взаимодействия в родной опухоли микроокружения (ТМЕ). Следовательно эти модели плохо пилки физиологических условиях, что приводит к аберрантных клеток поведения, включая неестественным морфологии, нерегулярные рецептор Организации, поляризацию мембраны и аномальный ген выражение, среди других условия1,2,3,4. С другой стороны 3D клеточной культуры, где клетки раскрываются в объемном пространстве, как агрегатов, сфероидов или organoids, предлагает альтернативный метод для создания более точной в vitro условий для изучения фундаментальных клеточной биологии и физиологии. Модели 3D клетки культуры может также стимулировать клетки ECM взаимодействий, которые являются критическим физиологические характеристики родной TME в пробирке1,4,5. Новые 3D подложке технология обеспечивает возможности для построения моделей, которые имитируют гетерогенных TME.
Является производным от быстрое прототипирование 3D подложке и позволяет изготовление 3D микроструктур, которые способны подражая некоторых сложностей живых тканей образцы6,7. Текущий подложке методы включают струйный, экструзии и при содействии лазерной печати8. Среди них метод экструзии позволяет неоднородность управляться в пределах печатной матрицы путем точного позиционирования различных видов материалов в разных местах первоначального. Таким образом он является наилучшим подходом для изготовления гетерогенных в vitro модели с участием нескольких типов клеток или матрицы. Экструзии подложке успешно используется для построения аурикулярных формы подмостей9, сосудистых структур10,11,12и кожные ткани13, что приводит к высокой печати верности и ячейки жизнеспособности. Технология также имеется универсальный материал выбора, возможность хранение материалов с клетками, внедренные с известным плотность и высокую воспроизводимость14,,1516,17 . Натуральные и синтетические гидрогели часто используются как bioinks для 3D подложке из-за их биосовместимости, биологическую и их гидрофильные сетей, которые могут быть спроектированы для структурно напоминают ECM7,18 ,19,–20,–21,–22,–23. Гидрогели также выгодно, так как они могут включать клей сайты для клетки, структурные элементы, проницаемость для питательных веществ и газов, и соответствующие механические свойства для поощрения развития24ячейки. Например коллагеновая гидрогели предлагают Интегрин узлами крепления клетки можно использовать для подключения к матрице. Желатин, денатурированные коллаген, сохраняет аналогичные сайты адгезии клеток. В противоположность этому альгинат биоинертный но обеспечивает механическую целостность путем формирования сшивки с ионов двухвалентной25,26,27,28.
В этой работе мы разработали композитный гидрогеля как bioink, состоящая из альгината и желатин, с сходства в микроскопических архитектуру родной опухоли стромы. Груди раковых клеток и фибробластов были внедрены в гидрогелей и напечатаны через bioprinter на основе экструзии для создания 3D-модель, которая имитирует микроокружения в естественных условиях . Инженерии 3D окружающей среды позволяет раковые клетки для формирования многоклеточного опухоли сфероидов (MCTS) с высокой жизнеспособности для длительных периодов клеточной культуры (> 30 дней). Этот протокол демонстрирует методики синтеза композиционных гидрогели, характеризующие микроструктуру и печатными свойствами, подложке сотовой разнородных моделей, материалов и наблюдения за формирование MCTS. Эти методы могут быть применены к другим bioinks в экструзии подложке, а также различных конструкций, моделей разнородных тканей с потенциального применения наркотиков скрининг, клетки миграции анализов и исследований, которые сосредоточены на основных клеток физиологические функции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ячейки Ладена структуры может быть нарушена, если загрязнение (биологическое или химическое) происходит в любой точке процесса. Обычно биологическое загрязнение рассматривается после двух или трех дней культуры как цвет изменения в культуре средств массовой информации или bioprinted стру…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Дао Цзян благодарит Китай Стипендиальный Совет (201403170354) и МакГилл инженерных докторской премии (90025) для финансирования их стипендию. Хосе G. Мунгиа-Лопес спасибо КОНАСИТ (250279, 290936 и 291168) и FRQNT (258421) для финансирования их стипендию. Сальвадор Флорес-Торрес спасибо КОНАСИТ за их стипендию финансирования (751540). Джозеф м. Kinsella благодаря национальной науки и инженерных исследований Совет, Канадский фонд для инноваций, Фонд семьи Таунсенд-Lamarre и Университет Макгилла для их финансирования. Мы хотели бы поблагодарить Аллен Ehrlicher за предоставленную нам возможность использовать его Реометр, Dan Николау за предоставленную нам возможность использовать его конфокального микроскопа и Мораг парк для предоставления нам доступа к дневно обозначенные клеточных линий.
Materials
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
Referências
- Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
- Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
- Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
- Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
- Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
- Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
- Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
- Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engenharia. 1 (2), 269-274 (2015).
- Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
- Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
- Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
- Coussot, P. . Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , (2005).
- Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020 (2016).
- Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
- Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003 (2016).
- Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
- Bingham, E. C. . Fluidity and plasticity. , (1922).
- Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
- Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).
