Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D In Vitro modelo sistemas inducen formación de glóbulo esferoide
Summary
Hemos desarrollado un modelo de cáncer de mama heterogéneos consistiendo en las células fibroblastos y tumor inmortalizadas encajadas un bioink de alginato/gelatina de bioprintable. El modelo recoge el microambiente tumoral de en vivo y facilita la formación de esferoides multicelulares tumor, dando la penetración en los mecanismos de conducción tumorigenesis.
Abstract
La heterogeneidad celular, bioquímica y Biofísica del microambiente tumoral nativo no es recapitulada por creciente líneas celulares de cáncer inmortalizadas mediante cultivo celular (2D) bidimensional convencional. Estos retos pueden superarse mediante técnicas de bioprinting para construir modelos de tumor heterogéneo de (3D) tridimensional por el que se encajan los diferentes tipos de células. Alginato y la gelatina son dos de los biomateriales más comunes empleados en bioprinting debido a su biocompatibilidad, biomimética y propiedades mecánicas. Mediante la combinación de dos polímeros, logramos un hidrogel compuesto de bioprintable con similitudes a la arquitectura microscópica de un tejido conectador tumoral nativo. Estudiamos la imprimibilidad de hidrogel compuesto por reología y obtiene la ventana de impresión óptima. Fibroblastos y las células de cáncer de mama fueron incrustados en los hidrogeles e impreso para formar un modelo 3D que mímico el microambiente en vivo . El modelo heterogéneo de bioprinted alcanza una alta viabilidad de cultivos celulares a largo plazo (> 30 días) y promueve el automontaje de las células de cáncer de mama en esferoides multicelulares tumor (MCTS). Se observan la migración y la interacción de las células de fibroblastos asociada al cáncer (CAF) con el MCTS en este modelo. Mediante el uso de plataformas de la cultura de célula bioprinted como sistemas de co-cultivo, ofrece una herramienta única para estudiar la dependencia de tumorigénesis de la composición del estroma. Esta técnica cuenta con un alto rendimiento, bajo costo y alta reproducibilidad, y también puede proporcionar un modelo alternativo a los cultivos de monocapa de celulares convencionales y modelos animales de tumor para el estudio de la biología del cáncer.
Introduction
Aunque cultivo celular 2D es ampliamente utilizado en la investigación del cáncer, existen limitaciones como se cultivan las células en forma de monocapa con una concentración uniforme de nutrientes y oxígeno. Estas culturas carecen de importante célula-célula y las interacciones célula-matriz presentan en el microambiente del tumor nativo (TME). En consecuencia, estos modelos mal recapitulan las condiciones fisiológicas, lo que resulta en comportamientos aberrantes de la célula, incluyendo morfologías antinaturales, organización irregular del receptor, polarización de la membrana y expresión de genes anormales, entre otros condiciones1,2,3,4. Por otra parte, cultivo celular 3D, donde las células se expanden en un espacio volumétrico como agregados, esferoides, organoides, ofrece una técnica alternativa para crear ambientes en vitro más precisas para estudiar la fisiología y biología de la célula fundamental. Modelos de cultura celular 3D también pueden fomentar las interacciones célula-ECM que son la fundamentales características fisiológicas de los TME nativo en vitrode4,1,5. La tecnología emergente de bioprinting 3D ofrece posibilidades para construir modelos que imitan el TME heterogéneo.
Bioprinting 3D se deriva de prototipado rápido y permite la fabricación de microestructuras 3D que son capaces de imitar algunas de las complejidades de la vida tejido muestras6,7. Los métodos actuales de bioprinting incluyen chorro de tinta, extrusión y asistida por láser impresión8. Entre ellos, el método de extrusión permite la heterogeneidad a ser controlada dentro de las matrices impresas colocando precisamente distintos tipos de materiales en diferentes lugares iniciales. Por lo tanto, es el mejor enfoque para fabricar heterogéneos en vitro modelos que involucran a múltiples tipos de células o matrices. Bioprinting de extrusión se ha utilizado con éxito para construir andamios forma auricular9,11,de10,12de estructuras vasculares y tejidos13, resultando en la célula y alta fidelidad de impresión de la piel viabilidad. La tecnología también ofrece selecciones de material versátiles, la capacidad de depósito de materiales con células con una densidad conocida y alta reproducibilidad14,15,16,17 . Hidrogeles naturales y sintéticos se utilizan con frecuencia como bioinks para 3D bioprinting debido a su biocompatibilidad, bioactividad y sus redes hidrofílicos que pueden ser diseñados para parecerse estructuralmente a la ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Los hidrogeles también son ventajosos ya que pueden incluir sitios de adhesivo para las células, elementos estructurales, permeabilidad de gases y nutrientes, y las adecuadas propiedades mecánicas a la célula de desarrollo24. Por ejemplo, hidrogeles de colágeno ofrecen integrina sitios de anclaje que las células pueden utilizar para atar a la matriz. Gelatina, colágeno desnaturalizado, conserva sitios de adherencia de células similares. En contraste, el alginato es bioinert pero proporciona integridad mecánica mediante la formación de reticulaciones con iones divalentes25,26,27,28.
En este trabajo, hemos desarrollado un hidrogel compuesto como un bioink, compuesto de alginato y gelatina, con similitudes a la arquitectura microscópica de un tejido conectador tumoral nativo. Fibroblastos y las células de cáncer de mama fueron encajados en los hidrogeles e impresión por medio de una bioprinter basada en la extrusión para crear un modelo 3D que imita el microambiente en vivo . El entorno 3D ingeniería permite las células cancerosas para formar esferoides multicelulares tumor (MCTS) con una alta viabilidad por largos períodos de cultivo celular (> 30 días). Este protocolo muestra las metodologías de síntesis de hidrogeles compuestos, caracterización de la microestructura e impresión, bioprinting celular modelos heterogéneos, los materiales y observar la formación de MCTS. Estas metodologías se pueden aplicar a otros bioinks en bioprinting de extrusión así como diversos diseños de modelos de tejido heterogéneo con potenciales aplicaciones en detección de drogas, ensayos de migración de la célula y estudios que se centran en la célula fundamental funciones fisiológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estructuras cargadas de celulares pueden ser comprometidas si contaminación (biológica o química) se produce en cualquier momento del proceso. Generalmente, contaminación biológica es vista después de dos o tres días de la cultura como un color cambia en los medios de cultivo o de la estructura de bioprinted. Por lo tanto, la esterilización (desinfección física y química) es un paso clave para todos los procesos relacionados con la célula. Notable, gelatina de autoclave cambia sus propiedades gelificantes, qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tao Jiang gracias el Consejo de becas de China (201403170354) y el Premio de Doctorado Ingeniería de McGill (90025) para la financiación de su beca. Jose G. Munguia-Lopez gracias CONACYT (250279, 290936 y 291168) y FRQNT (258421) para la financiación de su beca. Salvador Flores Torres agradece a CONACYT la beca de financiación (751540). Joseph M. Kinsella gracias a la ciencia nacional y Consejo de investigación de ingeniería, la Fundación Canadiense para la innovación, la Fundación de la familia Townshend Lamarre y Universidad de McGill para su financiación. Nos gustaría agradecer a Allen Ehrlicher por permitirnos usar su reómetro, Dan Nicolau por permitirnos usar su microscopio confocal y Morag parque para nosotros otorgando acceso a líneas celulares fluorescencia marcada.
Materials
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
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