हम एक विषम स्तन कैंसर अमर ट्यूमर और fibroblast कोशिकाओं को एक में एंबेडेड के साथ मिलकर मॉडल विकसित एक alginate/ मॉडल vivo ट्यूमर microenvironment में recapitulates और कोशिकीय ट्यूमर spheroids के गठन की सुविधा, tumorigenesis ड्राइविंग तंत्र में अंतर्दृष्टि उपज ।
सेलुलर, जैव रासायनिक, और देशी ट्यूमर microenvironment के भौतिक विविधता बढ़ती अमर कैंसर कोशिका लाइनों पारंपरिक दो आयामी (2d) सेल संस्कृति का उपयोग करके recapitulated नहीं है । इन चुनौतियों का उपयोग करने के लिए विषम तीन आयामी (3 डी) ट्यूमर मॉडल जिससे कोशिकाओं के विभिंन प्रकार एंबेडेड है का निर्माण करने के लिए तकनीक का प्रयोग करके दूर किया जा सकता है । Alginate और जिलेटिन की दो सबसे आम उनके की वजह से उनकी असंगति, नकल, और यांत्रिक गुणों के कारण प्रिंटिंग में कार्यरत माल है । दो पॉलिमर के संयोजन से, हम एक देशी ट्यूमर स्ट्रोमा की सूक्ष्म वास्तुकला के लिए समानता के साथ एक विमुद्रित समग्र hydrogel हासिल की । हम rheology के माध्यम से समग्र hydrogel के मुद्रण का अध्ययन किया और इष्टतम मुद्रण खिड़की प्राप्त की । स्तन कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts hydrogels में एंबेडेड और एक 3 डी vivo microenvironment में नकल उतार मॉडल बनाने के लिए मुद्रित किया गया । विमुद्रित विषम मॉडल लंबी अवधि के सेल संस्कृति के लिए एक उच्च व्यवहार्यता प्राप्त (> 30 दिन) और कोशिकीय ट्यूमर spheroids (MCTS) में स्तन कैंसर की कोशिकाओं की आत्म विधानसभा को बढ़ावा देता है । हम इस मॉडल में MCTS के साथ प्रवास और कैंसर से जुड़े fibroblast कोशिकाओं (CAFs) की बातचीत मनाया । सह संस्कृति प्रणालियों के रूप में मुद्रित सेल संस्कृति प्लेटफार्मों का उपयोग करके, यह स्ट्रोमा संरचना पर tumorigenesis की निर्भरता का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा उपकरण प्रदान करता है । इस तकनीक के एक उच्च प्रवाह, कम लागत, और उच्च reproducibility सुविधाएं, और यह भी पारंपरिक कोशिका monolayer संस्कृतियों और पशु ट्यूमर मॉडल के लिए एक वैकल्पिक मॉडल प्रदान करने के लिए कैंसर जीवविज्ञान का अध्ययन कर सकते हैं ।
हालांकि 2d सेल संस्कृति व्यापक रूप से कैंसर अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है, सीमाओं के रूप में कोशिकाओं को पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की एक समान एकाग्रता के साथ एक monolayer प्रारूप में हो रहे है मौजूद हैं । इन संस्कृतियों में महत्वपूर्ण कोशिका-कोशिका और कोशिका-मैट्रिक्स बातचीत में मौजूद देशी ट्यूमर microenvironment (टीएमई) का अभाव है. नतीजतन, इन मॉडलों खराब दोहराऊंगा शारीरिक स्थितियों, ंयायपालिका सेल व्यवहार में जिसके परिणामस्वरूप, अप्राकृतिक morphologies सहित, अनियमित रिसेप्टर संगठन, झिल्ली ध्रुवीकरण, और असामांय जीन अभिव्यक्ति, अंय के अलावा अटी१,२,३,४. दूसरी ओर, 3d सेल संस्कृति, जहां कोशिकाओं समुच्चय, spheroids, या organoids के रूप में एक volumetric अंतरिक्ष में विस्तारित कर रहे हैं, एक वैकल्पिक तकनीक के लिए और अधिक सटीक बनाने के लिए इन विट्रो वातावरण में मौलिक कोशिका जीवविज्ञान और फिजियोलॉजी अध्ययन प्रदान करता है । 3d सेल कल्चर मॉडल्स भी सेल-ECM इंटरैक्शन को प्रोत्साहित कर सकते हैं जो कि इन विट्रो1,4,5में देशी टीएमई की महत्वपूर्ण शारीरिक विशेषताएँ हैं. उभरते 3d प्रिंटिंग प्रौद्योगिकी विषम टीएमई की नकल करने वाले मॉडलों का निर्माण करने की संभावनाएं प्रदान करती है ।
3 डी प्रिंटिंग रैपिड प्रोटोटाइप से ली गई है और 3 डी microstructures के निर्माण के लिए सक्षम है कि जीवित ऊतक नमूने6,7की जटिलताओं के कुछ नकल उतारने में सक्षम हैं । वर्तमान inkjet, बाहर निकालना, और लेजर की सहायता से प्रिंटिंग8मुद्रण विधियों में शामिल हैं । उनमें से, बाहर निकालना विधि विविधता मुद्रित मैट्रिक्स के भीतर ठीक अलग प्रारंभिक स्थानों पर सामग्री के विभिंन प्रकार की स्थिति द्वारा नियंत्रित किया जा करने के लिए अनुमति देता है । इसलिए, यह सबसे अच्छा तरीका है इन विट्रो कोशिकाओं या मैट्रिक्स के कई प्रकार के शामिल मॉडल में विषम बनाना है । बाहर निकालना auricular के आकार का पाड़9बनाने के लिए सफलतापूर्वक प्रयोग किया गया है, संवहनी संरचनाओं10,11,12, और त्वचा के ऊतकों13, उच्च मुद्रण निष्ठा और सेल में जिसके परिणामस्वरूप व्यवहार्यता. प्रौद्योगिकी भी बहुमुखी सामग्री चयन सुविधाएं, एक ज्ञात घनत्व के साथ एंबेडेड कोशिकाओं के साथ सामग्री जमा करने की क्षमता, और उच्च reproducibility14,15,16,17 . प्राकृतिक और सिंथेटिक hydrogels अक्सर 3 डी उनके के लिए अपनी असंगति के कारण प्रिंटिंग के लिए स्याही के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, और उनके हाइड्रोफिलिक नेटवर्क है कि संरचनात्मक रूप से ECM7,18 के समान इंजीनियर जा सकता है ,19,20,21,22,23. Hydrogels भी लाभप्रद के बाद से वे कोशिकाओं के लिए चिपकने वाली साइटों, संरचनात्मक तत्वों, पोषक तत्वों और गैसों के लिए पारगम्यता शामिल कर सकते हैं, और उपयुक्त यांत्रिक गुण सेल विकास24को प्रोत्साहित करने के लिए कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, कोलेजन hydrogels प्रस्ताव integrin anchorage साइटों है कि कोशिकाओं का उपयोग कर सकते है मैट्रिक्स को देते हैं । जिलेटिन, विकृत कोलेजन, इसी तरह के सेल आसंजन साइटों को बरकरार रखे हुए है । इसके विपरीत, alginate निष्क्रिय है, लेकिन divalent आयनों25,26,27,28के साथ crosslinks बनाने के द्वारा यांत्रिक अखंडता प्रदान करता है ।
इस काम में, हम एक bioink के रूप में एक समग्र hydrogel विकसित की है, alginate और जिलेटिन के शामिल, एक देशी ट्यूमर स्ट्रोमा की सूक्ष्म वास्तुकला को समानता के साथ । स्तन कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts hydrogels में एंबेडेड और एक बाहर निकालना आधारित के माध्यम से मुद्रित किया गया एक 3 डी मॉडल है कि vivo microenvironment में नकल करता है बनाने के लिए । इंजीनियर 3 डी वातावरण कैंसर की कोशिकाओं को सेल संस्कृति की लंबी अवधि के लिए एक उच्च व्यवहार्यता के साथ कोशिकीय ट्यूमर spheroids (MCTS) फार्म की अनुमति देता है (> 30 दिन) । इस प्रोटोकॉल synthesizing समग्र hydrogels के तरीके को दर्शाता है, निस्र्पक सामग्री microstructure और मुद्रण, प्रिंटिंग सेलुलर विषम मॉडल, और MCTS के गठन देख । इन तरीकों को बाहर निकालना में अंय स्याही के रूप में अच्छी तरह के रूप में दवा स्क्रीनिंग, सेल प्रवास परख में संभावित अनुप्रयोगों के साथ विषम ऊतक मॉडल के विभिंन डिजाइनों के लिए लागू किया जा सकता है, और अध्ययन है कि मौलिक सेल पर ध्यान केंद्रित शारीरिक कार्य करता है ।
प्रदूषित (जैविक या रासायनिक) प्रक्रिया में किसी भी बिंदु पर होता है, तो सेल से लदी संरचनाओं समझौता किया जा सकता है । आमतौर पर, जैविक संदूषण संस्कृति के दो या तीन दिनों के बाद संस्कृति मीडिया या प्रिंटेड स…
The authors have nothing to disclose.
ताओ जियांग धंयवाद चीन छात्रवृत्ति परिषद (२०१४०३१७०३५४) और मैकगिल इंजीनियरिंग डॉक्टरेट पुरस्कार (९००२५) उनके छात्रवृत्ति वित्त पोषण के लिए । जोस जी Munguia-लोपेज धंयवाद CONACYT (२५०२७९, २९०९३६ और २९११६८) और उनके छात्रवृत्ति वित्त पोषण के लिए FRQNT (२५८४२१) । साल्वाडोर Flores-Torres धंयवाद CONACYT उनके छात्रवृत्ति वित्त पोषण के लिए (७५१५४०) । यूसुफ एम Kinsella धंयवाद राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, कनाडा नवाचार के लिए फाउंडेशन, Townshend-Lamarre परिवार फाउंडेशन, और उनके धन के लिए मैकगिल विश्वविद्यालय । हम हमें अपने फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की अनुमति देने के लिए हमें अपने rheometer, दान Nicolau का उपयोग करने की अनुमति के लिए एलन Ehrlicher शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और Morag पार्क हमें फ्लोरोसेंट लेबल सेल लाइनों तक पहुंच प्रदान करने के लिए ।
Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
MilliQ water | Millipore | N/A | |
Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
Water bath | VWR | N/A | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |