Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。
Summary
Bioprintable アルギン酸/ゼラチン bioink に埋め込まれた腫瘍、線維芽細胞の不死化細胞で構成される異種乳房癌モデルを開発しました。モデルは、生体内で腫瘍微小環境を繰り返すし、腫瘍形成を駆動メカニズムに洞察力をもたらす多細胞腫瘍スフェロイドの形成を促進します。
Abstract
ネイティブ腫瘍微小環境の細胞・生化学・生物物理学的不均一性がない成長不死化癌細胞を用いた従来の二次元 (2 D) の細胞培養で締めくくっています。異なったタイプの細胞が埋め込まれているという異種の三次元 (3 D) 腫瘍モデルを構築するバイオプリンティング技術を使用して、これらの課題を克服できます。アルギン酸、ゼラチン、バイオプリンティング生体適合性、バイオミミ クリー、機械的性質などに採用されている最も一般的な生体材料の 2 つです。2 つのポリマーを用いて、ネイティブの腫瘍間質の微細なアーキテクチャに類似し、bioprintable 合成ハイドロゲルを達成しました。レオロジーを介して複合ゲルの印刷適性を検討し、最適な印刷ウィンドウを取得します。乳癌細胞と線維芽細胞が、ヒドロゲルに埋め込まれ、生体内の微小環境を模倣した 3 D モデルを形成する印刷します。Bioprinted 異種モデルの長期細胞培養 (> 30 日) 高い生存率を実現し、促進する、回転楕円体細胞腫瘍 (MCT) に乳がん細胞の自己集合。移行とこのモデルに MCTS 癌関連付けられている線維芽細胞 (CAFs) の相互作用を観察した.共培養システムとして bioprinted 細胞文化のプラットフォームを使用して、それは腫瘍の間質組成依存性を研究するユニークなツールを提供しています。このテクニックを備えて高スループット、低コストと高い再現性と従来の細胞単層培養する代替モデルとがんの生物学を研究する動物腫瘍モデルも提供できます。
Introduction
2次元細胞培養は、がん研究で広く使用されますが、セルは、栄養素や酸素の濃度が均一膜形式で育つように制限があります。これらの文化は重要な細胞を欠いているし、ネイティブの腫瘍微小環境 (TME) に存在する細胞マトリックスの相互作用。したがって、これらのモデルは悪い生理的に不自然な形態、不規則な受容体組織、膜の分極と他の間で、異常な遺伝子発現を含む異常な細胞の行動の結果を要約します。条件1,2,3,4。その一方で、セルが集計、回転楕円体、または organoids として体積空間で展開されている 3 D 細胞培養基本の細胞生物学および生理学を勉強するより正確な体外環境を作成する方法を提供しています。3 D 細胞培養モデルもネイティブ TMEの in vitro1,4、5の重要な生理学的特性は、細胞外マトリクス相互作用を促すことができます。新興 3 D バイオプリンティング技術は、異機種混在の TME を模倣するモデルを構築する可能性を提供します。
3 D バイオプリンティング ラピッドプロトタイピングから派生でき、生活の複雑さのいくつかを模倣することができる 3 D 微細構造の作製組織サンプル6,7。インク ジェット、押出成形、レーザー印刷8など現在バイオプリンティング法。中でも、押出法は、異なる初期の場所に材料の種類を正確に配置によって印刷された行列内で制御される不均一性をことができます。したがって、複数の種類のセルや行列を含む異種の in vitroモデルを作製する最善のアプローチです。押出バイオプリンティングは耳介の形の足場構築9、血管構造10、11,12, と皮膚の組織13、高い印刷再現性と細胞の結果に正常に使用されています生存率。技術はまた多彩な材料選択、埋め込まれて既知の密度と再現性の高い14,15,16,17 セルと材料を堆積する機能を備えてください。.天然および合成ハイドロゲル、生体親和性、活性、および ECM7,18 のように構造的にするように設計することができます彼らの親水性ネットワークによる 3 D バイオプリンティングの bioinks として多用します。、19,20,21,22,23。ヒドロゲルはセル、構造要素、栄養素、ガス透過性の接着剤のサイトを含めることができますのでを奨励する適切な機械的性質細胞開発24有利ないます。例えば、コラーゲン ゲルはインテグリン細胞を使用してマトリックスをアタッチ アンカレッジ サイトを提供しています。変性コラーゲン、ゼラチンには、同様の細胞接着サイトが保持されます。対照的に、アルギン酸は不活性が、二価イオン25,26,27,28架橋を形成することにより機械的完全性を提供します。
この作品、bioink、アルギン酸とネイティブの腫瘍間質の微細なアーキテクチャに類似し、ゼラチンの構成として合成ハイドロゲルを開発しました。乳癌細胞と線維芽細胞、ヒドロゲルに埋め込まれていたし、生体内の微小環境を模倣する 3 D モデルを作成する押し出しベースの bioprinter経由で印刷します。設計された 3 D 環境では、細胞培養 (> 30 日) 長期間にわたって高い生存率と回転楕円体細胞腫瘍 (MCT) を形成する癌細胞をことができます。このプロトコルは、複合ゲルの合成、材料の微細構造と印刷適性、バイオプリンティング細胞異種モデル、および MCT の形成を観察の方法論を示します。薬剤のスクリーニング、細胞移動分析および基礎的な細胞に焦点を当てる研究への応用可能性と押し出しバイオプリンティング同様異種組織モデルの異なるデザインに関しての他の bioinks にこれらの方法論を適用できます。生理機能。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞を含んだ構造は汚染 (生物的または化学) が、プロセスの任意の時点で発生した場合危険にさらされることができます。通常、2 つの後生物学的汚染を見てか、文化メディアまたは bioprinted 構造の変更に色として文化の 3 日間。したがって、滅菌 (物理的・化学的消毒) は、細胞に関連するすべてのプロセスの重要なステップです。注目すべき、オートクレーブ ゼラチンは、我々 の試験で?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tao 江は、彼らの奨学金の資金を中国公費 (201403170354) とマギル大学工学博士賞 (90025) をありがちましょう。G. ムンギア ホセロペス奨学金資金調達のため CONACYT (250279、290936、291168) と FRQNT (258421) のおかげでください。サルバドール フローレス トレス感謝 CONACYT 彼らの奨学金の資金 (751540)。ジョセフ ・ m ・ キンセラは、彼らの資金のイノベーション ・ タウンゼント ラマール家族財団・ マギル大学国立科学と工学の研究議会、カナダの財団を感謝します。彼のレオメータ ダン Nicolau 私たちに蛍光に分類されたセルの行へのアクセスを許可するための彼の共焦点顕微鏡と Morag 公園の使用を許可するために使用を許可するためアレン Ehrlicher に感謝したいと思います。
Materials
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
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