Summary
多能干细胞衍生畸胎瘤治疗策略的研究对干细胞治疗的临床翻译具有重要意义。在这里, 我们描述了一种协议, 首先, 在小鼠体内产生干细胞衍生的畸胎瘤, 然后, 选择性地靶向和治疗这些肿瘤在体内使用一个小动物辐照器。
Abstract
在全球范围内, "干细胞旅游" 这一无管制的干细胞移植的受害者越来越多, 这引起了人们对干细胞移植安全性的担忧。虽然分化而非未分化细胞的移植是常见的做法, 畸胎瘤仍然可以产生于残留的未分化干细胞在移植时的存在或自突变在分化细胞。由于干细胞疗法通常被提供到解剖敏感的部位, 即使是小肿瘤也可能在临床上造成毁灭性的破坏, 导致失明、瘫痪、认知异常和心血管功能障碍。手术进入这些场所的机会也可能有限, 使患者几乎没有治疗选择。因此, 控制干细胞不当行为对干细胞治疗的临床翻译至关重要。
外部光束辐射提供了一种有效的手段, 提供有针对性的治疗, 以减少畸胎瘤的负担, 同时尽量减少对周围器官的伤害。此外, 这种方法避免遗传操作或干细胞的病毒转导-这与额外的临床安全性和疗效问题有关。在这里, 我们描述了一种在小鼠体内创建多能干细胞衍生畸胎瘤的方案, 并应用外束放射治疗在体内选择性地消融这些肿瘤。
Introduction
在过去几十年里, 组织再生干细胞疗法的发展遇到了一些障碍, 阻碍了有效临床部署的努力。这些障碍包括分娩部位细胞保留不良、干细胞免疫原性和肿瘤形成畸胎瘤1的可能性。致瘤是特别的临床关注, 因为它可能有潜在的危害干细胞移植受者2。由于不受管制的干细胞注射而形成的肿瘤的说法已经在多个临床环境中报告了 3,4,5。畸胎瘤形成的可能性是多能干细胞 (psc) 发展中最经常提到的临床问题, 并导致多个高调胚胎干细胞 (esc) 和诱导多能干细胞 (ipsc) 的延迟和取消试验6,7,8,9。因此, 有迫切需要一个翻译调查致力于提供适当的治疗, 如果这些医源性肿瘤出现。
到目前为止, 控制干细胞不当行为的大多数策略都集中在减少有致瘤潜力为 2,10的 psc 数量上。遗憾的是, 畸胎瘤的形成只需要少量的残留细胞 (例如, 1 x10 4至 1 x10 5细胞11), 远远低于目前可用的检测 12所引用的检测限值,13. 使用这些预分配方法的其他限制包括效率低和费用高、依赖可能不适合较新的组织工程方法的单细胞悬浮液以及细胞的潜在损伤生存和雕刻。
很少有研究涉及畸胎瘤形成后的治疗方案。也许最深入研究的策略是将 "自杀" 基因整合到干细胞中 14,15。这种方法包括基因操纵干细胞, 以纳入诱导凋亡激活基因, 可通过药物刺激后注射激活, 从而提供一种救援方法, 如果注射细胞产生畸胎瘤。然而, 这种方法存在重大缺陷, 包括私营保安公司基因改造的非目标效应和耐药的逐渐发展的可能性 16.类似的方法利用小分子通过抑制抗凋亡途径诱导psc 选择性细胞死亡17。其他群体使用多能性表面标记抗体, 如 podocalyxin-like (podxl)18, 将其靶向 psc 的细胞死亡。小分子或抗体传递的时间如果传递过早, 将对 psc 的治疗潜力产生重大影响, 如果传递得太晚, 可能缺乏治疗效果。此外, 还没有研究以这种方式使用的小分子和抗体的系统性影响。
治疗这些肿瘤的另一种方法依赖于使用外束放射治疗 (ebrt)。ebrt 是目前用于治疗实体肿瘤的主要方法之一.欧洲 brt 的创新, 包括质子束和立体定向放射外科的发展, 使病理结构的目标增强, 同时避免对正常组织的损害, 使保形欧洲爆炸器成为解决畸胎瘤的理想选择在解剖敏感的结构中形成20。此外, 这种方法避免了基因操纵或病毒转导的干细胞, 这两个充满了额外的临床安全性和有效性的问题15。最后, 微辐照器的发展使 ebt 在啮齿类动物21中的应用成为可能。
在本文中, 我们演示了如何通过在小鼠体内注射人的 ipsc 来创建小动物形成畸胎瘤的模型。然后, 我们展示了如何应用 ebrt 选择性地消除这些肿瘤在体内与最小的损害周围的组织。这种方法为 psc 衍生的畸胎瘤提供了有针对性的治疗, 同时避免了生物分子和肽的系统传递以及 psc 的基因操纵所产生的非目标效应。为了调查目的, 我们提供了一个可选的步骤, 通过生物发光成像 (bri) 来跟踪肿瘤对放射治疗的反应。
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Protocol
这项动物实验是在斯坦福大学的机构审查委员会和实验动物护理管理小组下批准和进行的。
1. ipsc 的细胞培养
- 在涂有基底膜基质 (例如, matrigel, 称为以下基质) 的6孔板上重新编程而获得的人的 ipsc。
- 每天用在37°c 和 5% co 2 孵育的浓缩培养基 (见材料表) 改变 ipsc 的培养基.
- 一旦细胞达到80–90% 的融合 (大约每 4天), 每口添加1毫升重组细胞离解酶 (见材料表), 并在37°c 孵育5分钟。
- 5分钟后, 通过移液将细胞与井中分离, 将其转移到15毫升管中, 离心机以 300 x g.
- 离心后, 在1:1000 稀释时, 将上清液吸气并重新悬浮到浓缩培养基中 (见材料表)。
- 对离解的细胞进行细胞计数, 并以 2 x 10 5 至 4 x 10 5 的密度在基质涂层的6孔板上复制细胞.
2. 具有双融合报告基因的 ipsc 的转导
- 按常规情况在6孔板中通过 ipsc, 并添加含有6μml 己二胺溴的浓缩培养基 (见材料表)。
请注意:理想的菌落大小为200–400细胞/菌落, 以产生最高的传导效率。 - 在4°c 下, 采用液相变离心, 用 sw-29 转子在2小时内2小时, 将携带萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白 (fluc-egfp) 的病毒浓缩, 由人类泛素启动子 c 驱动。
- 在10的多重感染 (moi) 中将病毒精矿添加到6孔板中的 ipsc 中, 并在 5% co 2 的37°c 下孵育过夜。
请注意:通过荧光活化细胞分选 (facs) 扫描分析的单粒细胞荧光蛋白的表达, 确定了感染的多样性。 - 第二天, 在室温下, 以 300 x g 离心 ipsc 6 孔板 6分钟, 取出病毒。
- 每天根据协议使用丰富的培养基 (见材料表) 和段落来改变媒体。利用荧光显微镜测定 egfp 的近似转导效率。
- 30–40% 的效率足以进行外地资产管理系统的排序。如果至少有30-40% 的细胞表达 egfp, 则继续使用表示 egfp 的高保经济伙伴关系的低收入发展中国家。
- 为了证实 fluc 在体内的活性, 用 ffp 对表达 gfp 的细胞进行了平板处理, 每口井密度为 5, 000个细胞。
- 用生物发光记者探针 d-荧光素 (100μmol) 将被转移的细胞和非转染细胞 (将作为负对照) 培养 6小时. 用微板分光计测量生物发光。
3. 免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成背侧 psc 的移植
- 在含有人 ipsc 的6孔板中加入1毫升重组细胞离解酶混合物, 并在培养中使用双融合报告基因 (fluk-gfp) (见第2节) 孵育5分钟。
- 潜伏期后, 通过移液器抽吸和表达分散细胞。加入相同体积的培养基, 然后在 250 x g的离心机4分钟。
- 离心完成后, 吸气上清液溶液, 将细胞颗粒重新悬浮在30μl 的基质中, 并将其放在冰上, 以保持其在注射前的活力。使用血细胞仪确认 1 x 106细胞的收获。
- 如果使用双融合报告基因转染细胞, 将双阳性流式细胞 (从第2节) 悬浮在30μl 的基质中。
- 在8-10 的胸腺裸鼠中, 用2% 的氟与1L/min 氧进行麻醉, 然后用2% 的异氟醚与氧气的1L/min 进行维持。
- 使用 28.5 g 注射器, 将细胞基质混合物 (见材料表) 悬浮在侧翼的皮下空间, 目标是总共注射 5 x 10 3 至 5 x10 6 个细胞(每次注射约 100 ul) 。
- 如果计划长时间维持小鼠, 并预测大的肿瘤生长, 请考虑更有尾端注射的部位。
- 麻醉动物被允许在加热的垫子上恢复, 直到流动 (通常和 lt;1h) 与呼吸率, 脚趾的肤色监测, 直到流动。
4. 移植细胞的生物发光成像 (bi), 以评估细胞存活和畸胎瘤生长
- 在接种后的所需时间点, 对小鼠进行腹腔内注射 375 mg kg 的记者探针 d-luciferin。
- ip 注射10分钟后, 使用1分钟采集窗口, 每隔5分钟对麻醉动物中的生物发光信号进行30分钟的成像 (如步骤3.5 中所述)。
请注意:建议每周采集映像。麻醉是在成像过程中通过鼻锥输送吸入的异氟醚来维持的。 - 对于数据分析, 在 bl 信号上绘制感兴趣的区域 (roi), 然后在采集时间内进行归一化, 以每平方厘米 (光子) 的最大光子/秒为单位量化排放量.
5. 使用临床前图像引导的辐照器进行畸胎瘤照射 (图 1)
- 在1% 的氧气中使用2% 异氟烷的小鼠在 1 l/min 的流量下, 将鼠标放在一个击倒盒中。在鼠标完全麻醉后, 将其转移到图像引导的临床前辐照器的床上 (见材料表)。通过鼻锥持续通过2% 的异氟醚维持麻醉。
- 使用40kvp、2 ma x 射线光束获取一组360°投影图像, 并将其重建为各向同性像素大小为 0.2 mm 的体积图像。
- 使用 rt _ image 软件包 (http://rtimage.sourceforge.net/) 规划使用微 ct 图像的放射治疗, 并执行放射治疗。
请注意:所使用的治疗方案包括两个 225kvp x 射线光束, 定向通过表面的目标畸胎瘤, 同时绕过鼠标其余部分的表面, 并节省底层内脏。根据季度系统校准数据调整光束的曝光时间, 使目标肿瘤中心的剂量为6戈瑞。 - 连续三天重复治疗过程, 总共向目标肿瘤输送 1 8 戈瑞。
- 保持对动物的标准治疗后护理。
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Representative Results
注射小鼠通常会在4-8周后显示畸胎瘤的生长形成, bli 成像证实了这一点 (图 2)。当细胞分娩一个月后, 用18戈瑞的累积剂量照射, 肿瘤会急剧缩小, 导致荧光素酶信号显著下降 (图 2)。重要的是, 从辐照部位取5毫米的正常组织似乎没有任何重大损伤 (图 3)。
图 1: 使用 ebrt 治疗肿瘤的方案示意图.(a) 麻醉后的动物被放置在辐照的散热器上并固定。(b) 创建侦察图像, 将畸胎瘤本地化, 以便进行有针对性的治疗。(c) 使用 rt _ image 软件包, x 射线光束对齐以针对选定的肿瘤。在照射前, 准直器和动物的位置得到确认。(d) 每个辐射事件22, 总共向肿瘤靶点输送了6戈瑞的辐射。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 成功的细胞播种会导致相当大的肿瘤, 可以用辐射选择性地治疗.(a) 经治疗 (右) 和未经治疗 (左) 畸胎瘤的代表 bli 显示。共有 1 x 106 人在本构表达 fluce/ggfp 的人被注射到免疫缺陷小鼠的两个背侧。虽然未辐照的一面继续增长, 但辐照侧却大幅萎缩, 荧光素酶信号的下降就说明了这一点。(b) 这张线图显示了辐照与未辐照 psc 衍生肿瘤中荧光素酶信号的下降。(c) 体内畸胎瘤的体内卡尺测量随时间的变化。非辐照畸胎瘤的大小随着时间的推移而增加, 而辐照畸胎瘤的大小下降。(d) 未经治疗 (左) 和治疗的 psc 源性肿瘤 (右) 的总组织学显示, 在总共18戈瑞照射22后, 其大小明显缩小。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 有针对性的分娩对周围组织 (包括肝脏、肠道和肌肉) 的损害最小.周围组织没有辐射损伤的迹象, 包括保持细胞增殖和没有细胞衰老和凋亡。在14天的辐射后, 从辐照地点对这些组织进行了5毫米的取样。(a) 血红素 & eosin 染色显示相邻组织的正常结构。(b) ki67 染色 (在水中显示) 表明, 细胞增殖保存在肝脏、肠道和肌肉细胞中。核被 4 ', 6-二胺-2-苯丁胺 (dapi) 作反染色, 以蓝色显示。(c) β-半乳糖苷酶衰老检测没有显示细胞老化的证据 (即没有绿色染色)。(d) 末端脱氧核苷酸转移酶 (tdt) dutp 镍端标记 (tunel) 显示没有凋亡 (即在细胞核中没有红色染色)。核子与 dapi 进行反染色, 显示为蓝色22。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
"干细胞旅游" 受害者的临床前数据和传闻案例证实, 患上畸胎瘤的风险是与 psc 治疗23有关的一个严重缺陷。因此, 制定谨慎的方法来预防和治疗与干细胞疗法相关的肿瘤风险是促进再生干细胞疗法临床翻译的一个重要步骤。在本文中, 我们描述了一种方法的治疗靶向靶向 psc 相关畸胎瘤使用 ebrt 在小鼠模型中, 并显示了动态萎缩的辐照肿瘤使用 bi 成像。
我们利用人类 ipsc, 由慢病毒重新编程方法创建, 并注射在裸鼠模型中, 以重述体内畸胎瘤的形成。裸鼠的使用避免了早期免疫原性排斥反应的跨物种注射细胞。虽然免疫缺陷小鼠的使用增强了致瘤的潜力, 但同样的方案也可应用于使用小鼠 psc 的免疫能力小鼠。我们进一步介绍了本文中使用的 psc, 并应用双融合报告基因, 使交付细胞在体内的连续生物发光成像。通过使用报告基因成像, 可以在体内对 psc 或 psc 衍生物进行连续跟踪, 而无需依靠尸检和组织学来跟踪肿瘤24的大小或生长。此前的研究证实了 bi 信号强度与肿瘤大小25,26之间的相关性。用双融合记者基因标记 psc 是一个可选的步骤, 可以绕过, 以有利于其他方法的肿瘤负担量化, 如尸检。
对于辐射协议的修改, 不同的剂量可用于临床前肿瘤治疗。为了本文的目的, 我们选择在连续3天的时间里, 以3剂6戈瑞的方式给有代表性的动物治疗。不在一个环境中给出所有 18 gy 的优点是, 较低的辐射剂量间隔间隔限制了与 ebrt 相关的相邻组织损伤和发病率。在临床环境中接受 ebrt 的患者往往接受低剂量间隔在许多不同的治疗由于这些相同的原因27。如所述, 应遵循该议定书的其他步骤。
通过照射肿瘤消融是干细胞衍生畸胎瘤的一种有希望的治疗策略, 这些畸胎瘤往往被输送到手术无法进入的地区。这项研究提供了证据, 欧洲 brt 是治疗 psc 衍生畸胎瘤的有效工具。这种简单的方法需要获取一个主体的高分辨率 ct 图像, 之后可以开一系列辐射光束, 将目标照射到所需的剂量, 同时避免相邻的组织20。在这项研究中, 两个切向光束被用来治疗皮下 pscs 衍生畸胎瘤, 同时节省周围的组织, 以及对侧控制畸胎瘤。与依靠小分子、抗体和预分离以防止肿瘤形成的方法相比, ebrt 肿瘤治疗既有效又稳健, 临床上可行。
这种方法有很大的好处。首先, 外束辐射是一种临床公认的肿瘤治疗方式, 已被用于治疗许多类型的肿瘤, 包括生殖细胞肿瘤 19.与其他治疗策略不同, ebrt 不会在细胞输送之前或期间改变干细胞的功能特性 15.此外, trit 不会干扰所交付细胞的模式或数量, 因此对其潜在疗效的影响最小。与化疗相比, 靶向照射也减少了对其他器官的非目标损伤。最后, 无论预处理策略如何, tribt 都提供了一个 "故障安全" 选项, 在肿瘤形成的情况下可以依靠。尽管如此, 在未来采用 ecbrt 治疗干细胞相关畸胎瘤方面仍有局限性。首先, 这个过程需要反复的成像和治疗, 从临床角度来看, 这可能很繁琐。另外, 根据干细胞传递的位置, 如果辐射敏感组织在束途径中, 这种方法可能会被证明是更高的风险。最后, 如果干细胞在注射部位之外系统地传播, 并在多个器官中形成畸胎瘤, 如果没有明显的患者发病率, 可能很难实施这一战略。
总之, 我们提供了一个在小鼠模型中创建 psc 衍生畸胎瘤的模型, 并演示了一种可靠的微 ct 照射方法, 能够有针对性地减轻肿瘤负担。这些方法可用于比较 ebrt 与其他畸胎瘤治疗策略的疗效, 或评估 ebrt 在根除其他类型肿瘤中的价值。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢国家卫生研究院 r01 hl134830 (pkn)、k08 hl135343 (ks) 和 5f32hl134221 (jwr);霍华德休斯医学院 (asl);和斯坦福心血管研究所 (asl) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
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