Summary
כאן, אנו מציגים עבור ex-vivo ריאות סרטן מודל מחקה את השלבים של התקדמות הגידול ומסייעת לבודד גידול ראשוני, פרוטוקול מחזורי תאים סרטניים נגעים גרורתי.
Abstract
קשה לבודד תאים סרטניים בנקודות שונות של התקדמות הגידול. יצרנו שמחוץ ריאות מודל שיכול להציג את האינטראקציה של תאים סרטניים עם מטריצה טבעי וזרימת מתמיד של חומרים מזינים, כמו גם מודל זה מציג את האינטראקציה של תאים סרטניים עם רכיבים סלולרית רגילה מטריצה טבעי. המודל ריאות acellular ex-vivo נוצר על ידי בידוד בלוק לב-ריאה עכברוש והסרה של כל התאים באמצעות תהליך decellularization. הסמפונות העיקריים ממש קשורה מחוץ, תאים סרטניים מוצבים קנה הנשימה על ידי מזרק. התאים להזיז ואכלוס הריאה השמאלית. הריאה ממוקם אז מגיב ביולוגי שבו עורק הריאה מקבל זרם מתמיד של מדיה במעגל סגור. הגידול גדל על הריאה השמאלית הוא הגידול העיקרי. התאים הגידול מבודדים בתקשורת במחזור יאומנו. תאים סרטניים, תאי גידול בריאה הימנית נגעים גרורתי. דגם לונג הסלולר שמחוץ נוצר על-ידי דילוג על התהליך decellularization. כל דגם ניתן לענות על שאלות מחקריות שונות.
Introduction
גרורות סרטן הוא האשם מאחורי רוב מקרי מוות מסרטן, מהווה את האתגר האולטימטיבי במאמץ להילחם בסרטן. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לעצב עבור תרבות ארבע-ממדי התא (4-D) אשר יש מימד של זרימה, בנוסף צמיחת תאים (תלת-ממדי) תלת ממדי פרוטוקול. הוא מייצג ברורים משלושת השלבים של תהליך גרורות [קרי, הגידול העיקרי, מחזורי תאים סרטניים (CTCs), נגעים גרורתי].
בשלושת העשורים האחרונים, מדענים ברחבי העולם הניב של שפע ללא תחרות של מידע כדי להבין את המנגנונים את התקדמות גרורתי, סוגי סרטן שונים, זה שיפור הסיכוי התרופה או ההישרדות ללא התקדמות המחלה. ניהול קליני של כמה סוגי סרטן, כגון סרטן השד, שיפור משמעותי1; עם זאת, כמה סוגי סרטן, כגון סרטן ריאות, עדיין יש עניים הישרדות2. מודלים בעלי חיים במבחנה , ויוו סייעו ביצירת תובנות חדשות שהתקנתי לחזק את התפתחות המחלה. בשנים האחרונות, תא xenografts נגזר קו (CDX), החולה, נגזר xenografts (PDX) היה עניין נוסף כפי הם משמרים הרלוונטיים תכונות רבות של הגידול העיקרי אנושי3, כגון צמיחה קינטיקה, תכונות היסטולוגית, התנהגותית מאפיינים, ואת התגובה לטיפול. עם זאת, כל דגם יש מגבלות משלו כדי להבין את המנגנון של מערך CTC, גרורות אל איבר מרוחק4,5,6.
לאחרונה, פיתחנו מודל סרטן ריאות 4-D ex-vivo על ידי ניצול הרעיון של איברים מניפולציות, תרבית תאים מבוססת זלוף. היא מחקה את הצמיחה סרטן ריאות האנושית על ידי יצירת גושים סרטניים perfusable לגדול לאורך זמן עם בני אדם דומים מופרש סרטן ייצור חלבון7. הוא מייצג את החתימה ביטוי גנים מנבאת המסכן ההישרדות בחולים עם סרטן, גם מראה תגובה טיפולית באמצעות רגרסיה הגידול על ציספלטין בטיפול8,9. דגם לונג השתנה עוד יותר כך הוא יכול לדמות נגעים גרורתי. CTCs להתפתח להערכת הגידול העיקרי, intravasate, בורחת אל תוך הריאה contralateral כדי ליצור נגעים גרורתי10. ג'ין ביטוי מחקרים מראים פרופיל ביטוי מובהק של הגידול העיקרי, את CTCs, נגעים גרורתי, קולטנים upregulation את קבוצת המשנה של גנים הדרושים עבור פנוטיפ10. תהליך גרורתי זה מתרחש בשל נוכחותם של תנאים וחיסונים אצל חולים עם סרטן. היתרון של מודל זה הוא הנוכחות של מטריצה טבעי ואדריכלות, זלוף של חומרים מזינים שמוביל היווצרות גושים סרטניים. בנוסף, הוא גם מספק הזדמנות לחקור את ההשפעות של מרכיבים שונים של גידול microenvironment או סמים על הגידול התקדמות לאורך זמן. מודל זה יכול לשמש כדי לגדל מגוון של תאים סרטניים (סרטן ריאות, סרטן השד, סרקומה וכו) תרגיל מעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקולים עבור ניסויים בבעלי חיים היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש במכון מחקר המתודיסטי ביוסטון, מתבצעת על פי כל תקנות, חוקים ישימים, קווים מנחים ומדיניות.
1. עכברוש ריאות קציר
- עזים ומתנגד חולדה ספראג-Dawley 4 כדי 6-בת הזכר על ידי זריקה (IP) בקרום הבטן של קטאמין (100 מ ג/ק ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג) בהאגף שלו. להבטיח הרדמה על-ידי בדיקה היעדרות של התנועה כאשר הבוהן הינד האיבר הוא צבט עם מלקחיים.
- לאחר 10 דקות, מגלח את החזה והבטן, לנגב את העור עם מקלון chlorhexidine.
- מסירים את העור על ידי כשהרמתי אותו עם מלקחיים ועל ידי אם זה באזמל חד פעמיות. לאחר פתיחת בחלל בית-החזה על ידי אם עם האזמל, לבצע ניקור הדו-צדדיים על ידי חיתוך בצד הקדמי של כלוב הצלעות בצד השמאל וצד ימין של הסרעפת עם מספריים.
הערה: זה ניתוח ההישרדות. - . חכו הצלעות, להזריק 2 מ של הפארין (1,000 יחידות/mL) לתוך החדר הימני של הלב הפועם באמצעות מחט 27 גרם.
הערה: פעולה זו תמנע כל היווצרות של קרישי דם בריאה. - לחלוטין להסיר את כלוב הצלעות עם מספריים ובאותו מקום מחט 18 גרם של החדר השמאלי אוורור, עד הדם יוצא. לאחר מכן, להזריק 15 מ"ל תמיסת heparinized באגירה פוספט (יחידות/מ"ל; heparinized PBS) לתוך החדר הימני באמצעות מחט 25 גרם.
- לחתוך את נחות והסופריור הווריד הנבוב, שני ורידים גדולים מצד ימין של הלב, ו ריקון הריאות עם אוטם 10 נוספים ל- PBS heparinized בתוך החדר הימני באמצעות מחט 27 גרם.
הערה: הכלילי התחתון הוא מדמיין תחת התחתון של הלב ככלי קיבול גדול מלא דם אדום. באופן דומה, הווריד הנבוב העליון הוא מדמיין בחלק העליון של הלב ככלי קיבול גדול. - לחתוך את קנה הנשימה בבסיס של בלוטת התריס. הסר בזהירות את העורקים ברמה של וריד hemiazygos, סניפים של אבי העורקים בשער הניצחון.
- . תוציא החוצה מהבניין לב-ריאה בחלל בית-החזה ואת שאר הגוף עכברוש
- לבצע ventriculotomy על ידי חיתוך חצי ימינה ושמאלה החדרים ולמקם בהזמנה אישית שמולאו מראש 18 גרם מפלדת המחט בצינורית דרך החדר הימני לתוך עורק הריאה הראשי (PA).
- לאבטח את הצינורית עם עניבה משי 2-0, בזהירות לחשוף את החדר הימני אטריום.
- מקום המחיצה סכינים סטריליים הנשי של החדר השמאלי ואבטח אותו עם עניבה משי 2-0.
- ריקון בלוק לב-ריאה עם 20 mL heparinized PBS דרך הצינורית הרשות הפלסטינית ולמקם אותו בצינור 50 מ ל תרבות המדיה או heparinized PBS הכוללת.
הערה: עבור מודל הסלולר, עבור לשלב 3.1 כדי להגדיר את ביוריאקטור. עבור מודל acellular, המשך לשלב 2.1 עבור decellularization.
2. ריאות Decellularization
-
הכנה של היחידה decellularization
- להכין את כל decellularization קאמרית/בקבוק על ידי פירסינג שני חורים הפקק של סכינים סטריליים הנשי החורים (איור 1A ו 1B). לאבטח אותו עם טבעת ניילון שחורה בצד השני. באופן דומה, לקדוח חור אחד פקק בקבוק נוסף של הקובץ המצורף קבע תוך ורידי (איור 1C).
הערה: איור 1A ו- 1B הם באותו פקקי בקבוקים משני צדדים שונים. איור 1C הוא כובע שונים עם חור אחד כאמור לעיל בשלב 2.1.1. - לצרף צינור 0.5 אינץ (ב עורק הריאה או הרשות הסיום) וצינורות 6 אינץ (איור 1J) סכינים סטריליים נקבה מן בתוך פקקי בקבוקים (איור 1A ו 1B) ולצרף מנעול סכינים סטריליים זכר בקצוות. הגדר את המנעול עם בקבוק 500 מ"ל הקאמרית/הבקבוק decellularization.
- חבר קצה אחד של שני צינורות רגל 2 (אשר מחוברים עם מנעול סכינים סטריליים זכר) או בסוף הצינור משאבה (איור 1 H), אשר מוצמד לראש המשאבה (איור 1E ו 1F) על-ידי מחסנית (איור 1 ג'י) עם סכינים סטריליים נקבה מנעול (איור 1I).
- לחבר את הקצוות האחרים של רגל 2 הצינורות (מתוך שלב 2.1.3) כל ראש נעל זכוכית הנשי על המכסה קאמרית/בקבוק decellularization (איור 1 L).
- הגדר 250 מ ל heparinized PBS בקבוק (עם 200 מ של PBS) על-ידי תליית בקבוק הפוך על דוכן עם תום הפרוקסימלית של ערכה תוך ורידי (איור 1D) יש להוסיף את הפקק, ואת הקצה הדיסטלי החלפת הצינור רגל 2 מחובר decellularization c הפרובינציאלי האמבר/הבקבוק בקצה הרשות הפלסטינית (איור 1B). להתחבר הצינורית הזאת במרחק של הבקבוק להשליך.
הערה: הבקבוקים שוכנים בינות קרטון, כפי שמוצג באיור 1 K. הצינורות תוך ורידי לצאת הבקבוקים תלוי לוותר ריאגנטים ב לגרדום ריאות.
- להכין את כל decellularization קאמרית/בקבוק על ידי פירסינג שני חורים הפקק של סכינים סטריליים הנשי החורים (איור 1A ו 1B). לאבטח אותו עם טבעת ניילון שחורה בצד השני. באופן דומה, לקדוח חור אחד פקק בקבוק נוסף של הקובץ המצורף קבע תוך ורידי (איור 1C).
-
תהליך decellularization ריאות
- להפעיל את PBS heparinized, בלחץ זלוף הפיזיולוגיות של 30 מ מ כספית (איור 1 K) עד זורם בחופשיות בבקבוק decellularization הקאמרית/וצרף, ואז, הרחוב לב-ריאה עד הסוף הרשות הפלסטינית דרך הצינורית הרשות הפלסטינית.
- תמשיך לרוץ המשאבה ללא הרף, כך כל פתרון/מאגר עודף שבתוך decellularization הקאמרית/הבקבוק מקבל שנמחקו.
- הפעל את PBS heparinized דרך הרשות למשך 15 דקות, בלחץ זלוף של 30 מ מ כספית בשביל הכביסה הראשונית (איור 1 K).
- החלף את הבקבוק PBS heparinized 0.1% dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) במים יונים, perfuse הריאה עבור 2 h עבור decellularization.
- לאחר decellularization, perfuse יונים בלוק מים דרך לגרדום ריאות למשך 15 דקות.
- לאחר מכן, perfuse דטרגנט ללא יונית 1% במים יונים למשך 10 דקות.
- החלף הקאמרית/הבקבוק decellularization 500 מ ל- PBS בלוק בתוספת x 1 אנטיביוטיקה (פניצילין-סטרפטומיצין שהוא גוסס), שמירה על הריאה תלויה ללא פגע עם הפקק שבתוך הבקבוק.
- למחוק את ורידי להגדיר, שמכניסים את נקז רגל 2 מחובר המיכל ביטול חזרה עד לסוף עורק הריאה תא decellularization, ולהפעיל את המשאבה ב 6 מ ל/דקה (L איור 1).
- Perfuse הריאות בשביל 72 h ולשמור על שינוי טוב, מגניב עם אנטיביוטיקה כל 12 שעות.
הערה: הריאה acellular מוכן לשימוש מיידי. ניתן לאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט עד שהוא נדרש. אם כתמים ורודים או קרישי דם, ניתן לאבחן בבירור בתוך האונות ריאות, למחוק את הריאה. זה אפשרי לבחון באופן אקראי עבור ה-DNA או histopathology. Acellular ריאה מלאה לא יציג יהיה שטף התאים ואת 99.9% של ה-DNA.
הערה: בעת עבודה עם מודל הסלולר ריאות, לדלג על decellularization. הריאה שנקטפו (שלב 1) ניתן להגדיר ישירות באת ביוריאקטור.
3. ביוריאקטור הקמה
- להכין את הבקבוק ביוריאקטור את הפריטים הדרושים עבור הסידור.
- קודחים חורים שלוש אחת פקק בקבוק 500 מ"ל במרחק שווה ולתקן סכינים סטריליים הנשי בשלושת החורים, באמצעות טבעות ניילון שחור (איור 2A ו- 2B).
הערה: שני חורים, המנעול סכינים סטריליים מסתיים הפנים בחוץ, כאשר קצה אחד פונה בתוך הבקבוק. - לחתוך 6 משאבת צינור, 2 בצינור, 6 ב שפופרת, צינור 1.5 מטרים, צינור רגל 2 ו צינור oxygenator 10 רגל לכל ביוריאקטור.
- חתך של מחט נירוסטה 18 גרם ו, שוב, לחבר את הקצוות עם אבובים מסתיימים עבור בצינורית והכו אותי.
- לעטוף את הצינור oxygenator, עם סכינים סטריליים מחברים נעל בקצוות, על ברז חשמלי מחוט באמצעות קלטות autoclave (איור 2C).
- אוטוקלב הנ פריטים ולשמור אותם ב- UV אור למשך 10 דקות.
- קודחים חורים שלוש אחת פקק בקבוק 500 מ"ל במרחק שווה ולתקן סכינים סטריליים הנשי בשלושת החורים, באמצעות טבעות ניילון שחור (איור 2A ו- 2B).
- הרכבתי את המשאבה בתוך החממה תרבות תא רגיל (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) עם מרווח נאות בין המגשים להתאמה בקלות בקבוק 500 מ"ל.
- תרסיס אתנול 70% על הדיו משאבת וחבר את צינור משאבת טלפוניה נעל זכוכית נקבה בשני הקצוות המשאבה.
- להגדיר את oxygenator העוטפת רשת התיל ברז חשמלי בתוך החממה התרבות התא על-ידי חיבור קצה אחד (זרימה החוצה) של oxygenator צינור המשאבה ואת הקצה השני עם הצינור 1.5 מטרים ב ביוריאקטור.
- להגדיר את הבקבוק ביוריאקטור ב אבטחה ארון עם תנאים אספטי.
- לצרף של צימוד 3-way (צהוב) בראש של אחד Luers הנשי כדי לשלוט בזרימה דרך הרשות הפלסטינית.
- להתחבר עם צימוד בכיוון אחד (כחול) עוד המחיצה נעל נשית סכינים סטריליים תא זריעה דרך קנה הנשימה (2F איור).
- לחבר 2 באבובים מבחוץ (לבן) ו-6 באבובים בתוך הבקבוק לזרום התקשורת החוצה. מתאים מנעול סכינים סטריליים זכר לרכבת התחתית רגל 2 וצרף סגנון לוג סכינים סטריליים הנשי טי לספק נגישות כדי להוסיף או להסיר כל דבר.
- לצרף אחד הפתחים של המחבר-כיוונית (נקבה סכינים סטריליים לוג סגנון טי) של צימוד בכיוון אחד.
- לצרף רגל 2 צינורות מנעול סכינים סטריליים זכר, מנעול סכינים סטריליים הנשי.
- להוסיף 200 מ של RPMI1640 עם 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה תא תרבות בינוני (משתנה לפי דרישה תא) ולהעביר את ביוריאקטור החממה. לחבר את הצינור oxygenator שני הקצוות פתוחים (צימוד בכיוון אחד, מחבר טי) כדי להפוך אותו מגיב ביולוגי לולאה סגורה.
- מראש להפעיל את המשאבה ב 6 מ ל/דקה בתוך החממה התרבות תאים עם תא תרבות המדיה כדי למלא את oxygenator ואת צינורות, כך אין בועות אוויר קיימים הצנרת.
- ברגע הצינורות מלאים עם המדיה, לסגור את צימוד ולהסיר את הבקבוק ביוריאקטור מן החממה על ידי ניתוק של oxygenators משני קצוות הבקבוק ביוריאקטור.
- לשים את הבקבוק ביוריאקטור הקבינט אבטחה, עוברים תרבות המדיה באמצעות צימוד, לצרף צימוד דרך מחבר ה-סכינים סטריליים זכר את הצינורית הרשות הפלסטינית של לגרדום ריאות (acellular או סלולרי).
הערה: הנה זה ניתן להשתמש המודל acellular (בעקבות תהליך decellularization) או בלוק שנקטפו זה עתה לב-ריאה (קרי, המודל הסלולר, כפי שהוא שומר על תאי עכבר מקורית). - עוברים תרבות המדיה באמצעות צימוד בכיוון אחד כדי להסיר את כל האוויר וקושרים את הצינורית והכו אותי על חוט משי לקנה הנשימה.
- הקפד להימנע כל פיתול של הרשות הפלסטינית ושל קנה הנשימה. קרוב הפקק ביוריאקטור עם הריאות לגרדום בפנים, שוב, גילוח ורחיצה כירורגית להעביר את ביוריאקטור החממה ולהתחיל את המשאבה במהירות 6 מ לדקה.
- הפעל מדיה תרבות למשך 10-15 דקות לוודא כל האונות לקבל בניפוח הריאה נראה במצב טוב (איור 2G).
4. מודל גרורות, זריעה תא
הערה: להמשיך תא זריעה במודל ריאות הנ למחקר בצמיחה הגידול העיקרי. לשנות לגרדום ריאות (acellular או סלולרי) כדלקמן עבור דגם גרורתי.
- להוציא את ביוריאקטור עם לגרדום ריאות מן החממה ותשחיל אבטחה הקבינט.
- להשתמש מזרק נעל זכוכית לעבור 5 מ של תרבות התקשורת דרך קנה הנשימה לפתוח את הפקק ביוריאקטור עם התליה לגרדום ריאות (2F איור).
- בשלב זה, אדם נוסף נדרש כדי לסייע ב השינוי של הריאה למודל גרורתי.
- קבל משי 2-0 ומוכן להשתמש מלקחיים זוויתי כדי לגרום למעבר דרך קנה הנשימה בנקודת נגע הסתעפות.
- לקשור את קנה הנשימה הולך הריאה הימנית בנקודה נגע הסתעפות וסמנו את הזרימה החופשית של מדיה דרך קנה הנשימה לריאה שמאלית על-ידי העברת תרבות המדיה.
הערה: פעם אחת קנה הנשימה קשורה בנקודת נגע הסתעפות, תאים נזרע דרך קנה הנשימה באופן אוטומטי יופנו זרע אל האונות שמאל. זה יכול להיבדק לפני זריעה התאים על ידי התקשורת תרבות לדחוף דרך קנה הנשימה. במודל גרורתי, התקשורת יזיז האונות שמאל בלבד, אשר לנפח ולא את האונות נכון10. - הגדר מזרק נעל זכוכית 20 מ"ל על גבי הצינורית והכו אותי ולהוסיף בקרת האוויר תאים של סרטן הריאה (A549, H1299) ב- 50 מ של מדיה תרבות שלמה RPMI1640 (2F איור).
- לבצע את התא זריעת ב אבטחה ארון. להוסיף 15 מ"ל של תאים במזרק ולתת לו לעבור אונות הריאה על ידי הכבידה. להוסיף את שאר התאים לפני כל בועות האוויר לעבור דרך.
- Acellular ריאות זריעה, לאסוף את המדיה perfused מטפטף בתוך הבקבוק ביוריאקטור, נותן להם לעבור דרך קנה הנשימה שוב 3 x.
הערה: המדיה perfused יש לפעמים התאים הסרטניים נזרע. לכן, עבור יעיל זריעה, להחזיר התקשורת שוב קנה הנשימה דרך המזרק. - ברגע נזרע, להסיר את המזרק, לחכות 15 דקות, להוסיף מדיה טריים, ומחזירים את ביוריאקטור בחזרה אינקובטור. הסר כל בועות האוויר הצנרת.
- . הפעל את המשאבה כדי perfuse התקשורת ב 6 מ ל/דקה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הריאה שנקטפו עכברוש שומר על שלמות להערכת ו alveoli11 (איור 3A ו- 3B). על decellularization, רכיבי מטריצה חוץ-תאית הריאות acellular, כגון, fibronectin, האלסטין והקולגן, נשמרים11 (3C דמות תלת-ממד, 3E, 3F). Decellularization מוביל הסרה מלאה של תאי עכבר מקורית מתנת בריאות, אשר יכול להיות שנצפו על ידי hematoxylin אאוזין (H & E) צביעת מציג את ההיעדרות של התאים ועל ידי ניתוח הדנ א11 מציג ירידה בכמות הדנ א ( איור תלת-ממד ו- 3g). דגם לונג 4-D ex-vivo ניתן לצמוח כל סוג של תאים חסיד12. סרטן ריאות, פיברובלסט ריאות, סרטן השד ותאים סרקומה גדלו על ידי זריעה דרך קנה הנשימה11,12,13. המודל גרורות מאפשר עבור האוסף של רקמת הגידול העיקרי, CTCs נגעים גרורתי במרווחי זמן שונים על ידי כריתת10. H & E ההכתמה של הרקמות הראה להערכת שלם alveoli במודל בשני סלולרית ו- acellular (איור 3 H ו- 3עכשיו). דגם לונג 4-D acellular הוא מודל הרחבה את האינטראקציה בין מרכיבים שונים של microenvironment. דגם לונג 4-D הסלולר מספק של microenvironment ריאות תקין עם אין תאים חיסוניים14. ניתן להוסיף תאים חיסוניים למודל זה דרך להערכת ללמוד את השפעתם על הגידול ואת האינטראקציה עם תאים סרטניים. הפארמצבטית ואיכות של המודל יכול להיות מוערך על ידי םילעופה המודל כפילויות וניתוח הרקמות/התאים על ידי H & E ואימונוהיסטוכימיה באמצעות סמנים תא ספציפי. איור 4 מציג תרשים סכימטי המייצג את השלבים העיקריים הכרוכים ביצירת דגם 4-D ריאות ex-vivo .
איור 1: חובה על יחידת decellularization של לגרדום ריאות. כמוסות בקבוק 500 מ"ל (A ו- B) הם קדחו, מחברים סכינים סטריליים הנשי מוגדרים עם אבובים כדי ליצור את הבקבוקים decellularization. (ג) עוד פקק זקוק חור אחד בלבד כדי להגדיר (D) את ורידי להגדיר עבור ריאגנט הזורם דרך עורק הריאה של לגרדום ריאות. המשאבה מוגדר עם (F) משאבה, (E) ראש משאבת ולאחר (G) מחסנית. משאבה (H) אבובים עם מחברים סכינים סטריליים הנשית על כל הקצה, (אני) מחברים וצורות (J) צינורות עם סכינים סטריליים זכר מחברים בשני קצותיו נדרשים להגדיר (K) היחידה decellularization. פיגומים (L) הריאה נשטפים במשך 3-5 d במערכת לולאה סגורה עם 1 x PBS אנטיביוטיקה-antimycotic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הגדרת ביוריאקטור לתרבות ex-vivo 4-D ריאות תא. (A ו- B) ביוריאקטור פקקים (500 mL) הם קדחו, שלושה מחברים נעל זכוכית הנשי מוכנס ותוקנו עם טבעת ניילון שחור. (ג) 10 רגל של oxygenator צינור העוטפת ברז חשמלי מחוט מתכת-עם זכר טבעות מנעול אינטגרלי סכינים סטריליים בשני הקצוות. (D) של עורק הריאה בצינורית ו- (E) בצינורית בקנה הנשימה מוכנות באמצעות מחט 18 גרם של צינור משאבת. (F) A 20 מ"ל מזרק מוגדר המחבר לכיוון קנה הנשימה כדי להפיץ את התאים במרחב אפיתל של לגרדום ריאות. (G) לולאה סגורה ביוריאקטור הוא להגדיר בתוך החממה תרבות תא זלוף, הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: להחליפן בתמונות של דגם 4-D ריאות ex-vivo על גרורות. (א) רחוב בשלמותם לב-ריאה הוא שנקטפו 4 כדי 6-בת חולדה. Histopathology (B) מציגה את alveoli pneumocytes. (ג) Decellularization מוביל הסרה מלאה של תאי הריאה. (ד) Histopathology מראה של קרום המרתף ללא פגע עם הריאות acellular. (E ו- F) pentachrome ואלסטין הכתם של Movat מגלה הנוכחות של, פיברין, האלסטין והקולגן להערכת ללא פגע, סמפון. ניתוח (G) דנ א מראה ירידה ב- DNA תוכן של יותר מ- 99%. (H) הריאה הסלולר יכולים לשמש ישירות ביוריאקטור לתרבות תא, (אני) ניתוח היסטולוגית מראה הנוכחות של הגידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תרשים סכמטי מציג את המייג'ור שלבים ביצירת דגם 4-D ריאות ex-vivo . בשלב 1, רחוב לב-ריאה הוא שנקטפו חולדה. לפי הדרישה המחקר, בשלב 2, הריאות יכול גם לשמש ישירות מודל הסלולר או יכול להיות decellularized כדי להסיר תאים מקורית. השלב הבא כרוך בהגדרת המודל ריאות ביוריאקטור ו תא זריעה. לבסוף, ריאקטורים מוגדרים בחממה עבור התרבות תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הריאה 4-D שמחוץ מספקת הזדמנות ללמוד הגידול ו גרורות ב תרגיל מעבדה. מטריצה ריאות מקורית היא מערכת מורכבת מספק תמיכה הרקמות ומתחזק אינטראקציות תא-תא, התא-מטריקס אינטראקציות, התמיינות, בארגון רקמות. הוא מספק הזדמנות להוסיף רכיבים microenvironment הגידול ללמוד והשפעותיהם על הגידול ואת האינטראקציה עם תאים אחרים.
הקציר ריאות היא השלב הקריטי עבור דגם 4-D ריאות שמחוץ . עיכוב מתן הזריקה הפארין לאחר פתיחת בית החזה עלול לגרום קריש דם בריאות, העשויים להשפיע על זרימה חופשית של ריאגנטים במהלך decellularization. שטיפה נכונה עם heparinized PBS עד נוזל חסר צבע נובע האוורור חשוב, במיוחד עם המודל הסלולר. ניתוק זהיר החלול חשוב להימנע לפגוע הרשות הפלסטינית. במהלך תהליך decellularization, חשוב מאוד להימנע בועות אוויר נעים להגיע לגרדום ריאות. הנוכחות של בועות אוויר עשוי להאט או לעצור את הזרימה של ריאגנטים, לתרום decellularization לא תקין. בועות ניתן להסיר על ידי מוצץ את הבועות בעזרת מזרק 10-20 מ. חשוב מאוד לוודא שהצינורית הרשות לא מעוות. במהלך הסידור ביוריאקטור, כל סיבוביות הצנרת עשויה לגרום מוקפץ על המחברים, לגרום בלגן שלם בתוך החממה. כדי להימנע סיבוביות הצינורית, בצינורית/מחטים זעירות ניתן לחתוך וחוברו מחדש באמצעות צינורות מסתיימים, אשר מספקת את הגמישות הדרושים כדי לסובב את הצינורית מבלי להפריע את החיבורים. דליפה כלשהי של תרבות התקשורת בתוך החממה עשויים לדרוש נוסף בניקוי מקצועי. בעת יצירת המודל גרורות, תפירת זהירות נדרשת באתר נגע הסתעפות קנה הנשימה. כל חדירה של הריאות או קנה הנשימה עלול להוביל הדליפה של תאים ושל תוצאות לא עקביות.
הדגמים ריאות 4-D acellular, הסלולר שמחוץ יש מספר יתרונות בהשוואה תרביות תאים 3D קונבנציונליות כדי להבין טוב יותר את התקדמות סרטן, כפי שהם מספקים הזדמנות ללמוד את הצעדים העיקריים ביולוגי ב גרורה נוספת ממד של זרימה. שני הדגמים לחקות את הביולוגיה של הגידול, גרורות, מספקים הזדמנות לאסוף תאים סרטניים בשלבים שונים של הצמיחה סרטן כדי להבין טוב יותר את החתימות ג'ין התגובה לטיפולים, ההתפתחות של עמידות לתרופות. למרות זאת הוא מטריצה בריאה, זה יש הפוטנציאל לגדל מגוון של שורות תאים הוקמה ותאים הראשי. המגבלה של דגם 4-D שמחוץ היא הדרישה של > 10 מיליון תאים seeding כדי ללמוד על גרורות. תאים עם פוטנציאל proliferative נמוכה עשויה להימשך זמן רב יותר כדי להראות הנגע גרורתי. בנוסף, מודל זה דורש תנאים יותר aseptic ברגע התאים הם נזרע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מין עמ' קים קיבלה מענק תמיכה השני ג'ון וו קירקלין מחקר המלגה, האגודה האמריקאית החזי ניתוח, גראהם מחקר קרן, יוסטון המתודיסטית המומחיות רופא קבוצת גרנט, ואת מיכאל מ פרס מחקר של חרוט ה ג'ואן. אנו מודים Saikin אן על שפת עריכה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dowley rat | Harlan | 206M | Male |
| Chlorhexidine swab | Prevantics, NY, USA | NDC 10819-1080-1 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA | NDC 25021-400-10 | |
| 18-gauge needle | McMaster Carr, USA | 75165A249 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, San Angelo, TX, USA | A305H | |
| Masterflex L/S pump | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07554-80 | |
| Masterflex L/S pump head | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-05 | |
| Masterflex L/S pump cartridge | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-07519-70 | |
| Tygon Tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 14171211 | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-16 | |
| Female luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-34 | 75165A249 |
| Male luer lock connectors | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45513-04 | |
| black nylon ring | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | EW-45509-04 | |
| Intravenous set | CareFusion | 41134E | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | CAS151-21-3 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | |
| Silicone oxygenator | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | ABW00011 | Saint-GoBain- |
| Wire mesh | 1164610105 | Lowes | New York Wire |
| Female luer Lug Style TEE | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-56 | |
| Male luer integral lock ring to 200series Barb | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45518-08 | |
| Female luer thread style coupler | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 45508-22 | |
| Clave connector | ICU Medical | 11956 | |
| Hi-Flo ™4-way Stopcock w/swivel male luer lock | smith Medical | MX9341L | |
| MasterFlex Pump tube | Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA | 06598-13 | for cannula |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A.
- Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).
- Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
- Bissell, M. J., Hines, W. C. Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression. Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture. PloS One. 7 (9), e45308 (2012).
- Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).
- Mishra, D. K., et al. Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).
- Mishra, D. K., et al. Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis. The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).
- Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules. The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).
- Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model. Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).
- Mishra, D. K., et al. Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model. The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).
- Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model. BMC Cancer. 18 (1), 441 (2018).
