In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales
Summary
Nous présentons une en vivo biphotonique imagerie protocole d’imagerie du cortex cérébral de souris néonatales. Cette méthode convient pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la dynamique neuronale et les changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.
Abstract
L’imagerie biphotonique est un outil puissant pour l’analyse in vivo des circuits neuronaux dans le cerveau des mammifères. Cependant, un nombre limité de méthodes d’imagerie in vivo existe pour examiner le tissu cérébral des mammifères nouveau-nés vivants. Dans les présentes, nous résumons un protocole pour l’imagerie des neurones corticaux individuels dans la vie de souris néonatales. Ce protocole comprend les deux méthodes suivantes : (1) le système de Supernova pour l’étiquetage des rares et lumineux des neurones corticaux dans le développement du cerveau et (2) une intervention chirurgicale pour le crâne fragile néonatale. Ce protocole permet l’observation des changements temporels des neurites corticaux différents stades néonatale avec un rapport signal sur bruit élevé. Silençage génique de cellules spécifiques marqué et élimination directe est possible aussi en combinant la Supernova à l’interférence d’ARN et gène CRISPR/Cas9, systèmes de montage. Ce protocole peut, ainsi, être utilisé pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, mécanismes moléculaires qui régissent la dynamique neuronale et des changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.
Introduction
Le câblage précis des circuits de neurones dans le cortex cérébral est essentiel pour les fonctions cérébrales supérieures y compris la perception, cognition et apprentissage et la mémoire. Des circuits corticaux sont dynamiquement raffinés au développement postnatal. Des études ont étudié le processus d’utilisation de la formation des circuits corticaux histologique et analyses de la culture in vitro . Toutefois, la dynamique de la formation des circuits chez les mammifères vivants est restée pratiquement inexplorée.
Microscopie biphotonique a été largement utilisée pour l’analyse in vivo des circuits neuronaux dans le cerveau de souris adulte1,2. Toutefois, en raison de difficultés techniques, seulement un nombre limité d’études ont abordé la formation des circuits neuronaux chez des souris nouveau-nées. Par exemple, Carrillo et coll. effectuée l’imagerie Time-lapse de l’escalade des fibres du cervelet dans la deuxième semaine après la naissance3. Portera-Cailliau et coll. ont signalé l’imagerie des axones dans la couche corticale 1 dans la première semaine après la naissance4. Dans la présente étude, nous résumons un protocole pour l’observation des neurones corticaux de couche 4 et leurs dendrites chez des souris nouveau-nées. Obtenu par l’application de ce protocole, qui comprend deux méthodes, les résultats sont présentés dans notre récente publication5. Tout d’abord, nous utilisons la Supernova vector système5,6 pour l’étiquetage différents neurones dans le cerveau néonatal. Dans le système de la Supernova, les protéines fluorescentes utilisées pour l’étiquetage neuronale sont échangeables et étiquetées de gène spécifique des cellules et édition/knockout analyses sont également possibles. En second lieu, nous décrivons une procédure chirurgicale pour la préparation de la fenêtre crânienne en souris néonatales fragiles. Ensemble, ces méthodologies permettent l’observation in vivo des différents neurones dans le cerveau néonatal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des étapes cruciales dans le protocole et le dépannage :
L’étape la plus critique du protocole est l’ablation du crâne (étape 3.2 du protocole). Lors de l’insertion, la lame de rasoir adhère souvent à la dure-mère, provoquant des saignements dural et des dommages au cerveau. Cela peut être évité en ajoutant une goutte de tampon de cortex sur le crâne et en supprimant le crâne dans un tampon de cortex.
Hémorragie de la dure-mère et la peau après q…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient T. Sato, M. Kanbayashi et S. Kouyama pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant numéros JP15K14322 et JP16H06143, le FNS de Takeda, le Uehara Memorial Foundation et le projet de recherche Collaborative de Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M.) et par KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 et JP15H04263 et Grant-dans la recherche scientifique sur les domaines de l’Innovation « Règlement de dynamique de la fonction cérébrale de Scrap & système de génération » (JP16H06459) du MEXT (T.I.).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Autores | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Autores | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
Referências
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