נציג של ויוו שני הפוטונים הדמיה פרוטוקול הדמיה ההכרויות neonatal עכברים. שיטה זו מתאימה לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים הדינמיקות עצביים ועל שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.
שני הפוטונים הדמיה הוא כלי רב עוצמה לניתוח ויוו של מעגלים עצביים במוח של יונקים. עם זאת, מספר מוגבל של ויוו בשיטות הדמיה קיימים לבחינת על רקמת המוח של יונקים היילוד בשידור חי. בזאת אנו מסכמים את פרוטוקול הדמיה נוירונים בודדים בקליפת המוח בעכברים neonatal חי. פרוטוקול זה כולל את מתודולוגיות שני הבאים: (1) מערכת סופרנובה דלילים ובהירים תיוג של נוירונים בקליפת המוח המוח המתפתח, (2) הליך כירורגי על הגולגולת neonatal שביר. פרוטוקול זה מאפשר התבוננות שינויים הטמפורלי של הפרט neurites קורטיקלית בשלבים neonatal עם יחס אות לרעש גבוה. גם ניתן להשיג על ידי שילוב של הסופרנובה עם הפרעה RNA ו CRISPR/Cas9 ג’ין עריכה מערכות שכותרתו תא ספציפי ג’ין להחרשת, נוק אאוט. פרוטוקול זה, לכן, ניתן להשתמש לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים השולטים על דינמיקה עצביים, וכן שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.
החיווט מדויק של מעגלים עצביים בקליפת חיוני עבור תפקודי המוח כולל תפיסה, קוגניציה, למידה וזיכרון. מעגלים בקליפת המוח הם מעודן באופן דינמי במהלך הפיתוח כמחנכת. מחקרים חקרו את תהליך השימוש היווצרות מעגל קורטיקלית היסטולוגית וניתוחים in vitro לקשרי תרבות. עם זאת, הדינמיקה של היווצרות מעגל ביונקים החיים נשאר בעיקר נחקרו.
מיקרוסקופ שני הפוטונים כבר בשימוש נרחב עבור הניתוחים ויוו של מעגלים עצביים העכבר למבוגרים המוח1,2. עם זאת, בשל האתגרים הטכניים, רק מספר מצומצם של מחקרים עסקו מעגלים עצביים היווצרות בעכברים היילוד. לדוגמה, קאריו. ואח לביצוע ההדמיה בצילום מואץ של טיפוס סיבי המוח הקטן של שבוע לאחר הלידה השניה3. . Portera-Cailliau et al. דיווח על ההדמיה של אקסונים בשכבת קורטיקלית 1 שבוע לאחר הלידה הראשונה4. במחקר הנוכחי, אנו מסכמים את פרוטוקול להשגחה של נוירונים בקליפת המוח של שכבה 4, שלהם דנדריטים בעכברים היילוד. התוצאות המתקבלות על-ידי החלת פרוטוקול זה, הכולל שתי מתודולוגיות, מדווחים הפרסום האחרונה שלנו5. ראשית, אנו משתמשים5,6 מערכת וקטור סופרנובה עבור תיוג נוירונים בודדים במוח neonatal. במערכת סופרנובה, החלבונים פלורסנט משמש תיוג עצביים גנים ספציפיים תא להחלפה ומתויגים הינם ניתוחים עריכה/נוק-אאוט הינם אפשריים. שנית, אנו מתארים הליך כירורגי להכנה חלון הגולגולת בעכברים neonatal שביר. יחד, מתודולוגיות אלה מאפשרים התצפית ויוו של נוירונים בודדים במוח neonatal.
שלבים קריטיים בפרוטוקול לפתרון בעיות:
השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הינו של הגולגולת (פרוטוקול שלב 3.2). בשעת ההוספה, גילוח לאנאפוליס לעיתים קרובות השכבה הקשה של המוח, גורם לדימום. קרום נזק למוח. זה ניתן למנוע על-ידי הוספת טיפה של קליפת מאגר על הגולגולת והסרה הגולגולת במאגר בקל…
The authors have nothing to disclose.
המחברים תודה סאטו ט, מ Kanbayashi ו- Kouyama ס’ לסיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על- ידי JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP15K14322, JP16H06143, קרן המדע טקדה, קרן ההנצחה Uehara ו את שיתופי מחקר פרויקט של נייגאטה אוניברסיטת המוח מחקר מכון 2017-2923 (H.M.) KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, ו JP15H04263, במענק מחקר מדעי בתחומים חדשנות “דינמי ויסות תפקוד המוח על ידי גרוטאות & לבנות מערכת” (JP16H06459) מ- MEXT (רכב מורשה).
pK031. TRE-Cre | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from authors |
Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
Titanium bar | Autores | – | Custom made (see Figure 1G) |
Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
Titanium plate | Autores | – | Custom made (see Figure 2A) |
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |