Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais
Summary
Apresentamos um na vivo dois fotões protocolo para o córtex cerebral de ratos neonatais de imagem de imagem. Este método é adequado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e as mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.
Abstract
Imagem de dois fotões é uma poderosa ferramenta de análise de circuitos neuronais do cérebro de mamíferos na vivo . No entanto, um número limitado de no vivo de imagem métodos existe para examinar o tecido do cérebro de mamíferos recém-nascidos ao vivo. Aqui resumimos um protocolo para imagens individuais neurônios corticais em camundongos neonatais vivos. Este protocolo inclui as seguintes duas metodologias: (1) o sistema de Supernova para esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios corticais no cérebro em desenvolvimento e (2) um procedimento cirúrgico para o crânio neonatal frágil. Este protocolo permite a observação de mudanças temporais de neuritos corticais individuais durante estágios neonatais com uma alta relação sinal-ruído. Silenciamento de genes de células específicas rotuladas e nocaute também podem ser alcançados pela combinação da Supernova com interferência do RNA e gene CRISPR/Cas9 sistemas de edição. Este protocolo pode, assim, ser utilizado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.
Introduction
A fiação precisa de circuitos neuronais no córtex cerebral é essencial para funções superiores do cérebro incluindo a percepção, cognição e aprendizagem e memória. Circuitos corticais são dinamicamente refinados durante o desenvolvimento pós-natal. Estudos têm investigado o processo de formação de circuito cortical usando histológico e em vitro análises de cultura. No entanto, a dinâmica da formação do circuito em mamíferos viventes manteve-se na maior parte inexplorada.
Microscopia de dois fotões tem sido amplamente utilizada para as análises em vivo dos circuitos neuronais no cérebro do rato adulto1,2. No entanto, devido a desafios técnicos, somente um número limitado de estudos abordaram a formação do circuito neuronal em ratos recém-nascidos. Por exemplo, Carrillo et al realizaram a lapso de tempo imagem de fibras no cerebelo na segunda semana pós-parto3de escalada. Porteira-Cailliau et al relataram a imagem dos axônios na camada cortical 1 na primeira semana pós-natal4. No presente estudo, resumimos um protocolo para a observação de neurônios corticais de camada 4 e suas dendrites em camundongos recém-nascidos. Os resultados obtidos através da aplicação do presente protocolo, que inclui duas metodologias, são relatados em nossa recente publicação5. Primeiro, usamos a Supernova vetor sistema5,6 para rotular os neurônios individuais no cérebro neonatal. No sistema de Supernova, as proteínas fluorescentes usadas para rotular neuronal são knockdown exchangeable e etiquetados célula específica do gene e edição/nocaute análises também são possíveis. Em segundo lugar, descrevemos um procedimento cirúrgico para a preparação de janela cranial em camundongos neonatais frágil. Juntas, essas metodologias permitem a observação na vivo de neurônios individuais no cérebro neonatal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos no protocolo e solução de problemas:
O passo mais importante do protocolo é a remoção do crânio (passo 3.2 do protocolo). Mediante a inserção, a lâmina de barbear frequentemente adere a dura-máter, causando sangramento dural e danos ao cérebro. Isto pode ser evitado adicionando uma gota de buffer de córtex no crânio e removendo o crânio no buffer do córtex.
Sangramento da dura e a pele após preparação janela cranial leva a oclusão da…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer T. Sato, M. Kanbayashi e S. Kouyama para sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant números JP15K14322 e JP16H06143, a Takeda Science Foundation, Fundação Memorial Uehara e o Collaborative Research projeto de Niigata University cérebro Research Institute 2017-2923 (H.M) e KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 e JP15H04263 e Grant-em investigação científica nas áreas de inovação “Regulamento dinâmico da função cerebral por Scrap & Build System” (JP16H06459) do MEXT (T.I.).
Materials
| pK031. TRE-Cre | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Autores | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Autores | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Autores | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
Referências
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