Een kwantitatieve analyse van rodopsine, vervoer door High-Content Imaging analyse
Summary
We beschreven hier, een hoge-inhoud beeldvorming methode om te kwantificeren van het vervoer van rodopsine mutanten retinitis pigmentosa is gekoppeld. Een meerdere-golflengte scoren analyse werd gebruikt voor het kwantificeren van rodopsine eiwitten op het celoppervlak of in de hele cel.
Abstract
Rodopsine misfolding mutaties leiden tot de dood van rod fotoreceptor dat manifesteert zich als autosomaal dominante retinitis pigmentosa (RP), een progressieve ziekte die mist van effectieve behandeling verblindende. We veronderstellen dat de cytotoxiciteit van de mutant misfolded rhodopsine kan worden verlicht door het farmacologisch stabiliseren de mutant rhodopsine proteïne. De P23H mutatie, onder de andere klasse II rhodopsine mutaties, codeert een structureel unstable rhodopsine mutant eiwit dat is gecumuleerd in het endoplasmatisch reticulum (ER), overwegende dat de wild type rhodopsine wordt getransporteerd naar het plasmamembraan in zoogdieren cellen. Wij eerder uitgevoerd een scherm high-throughput luminescentie gebaseerde (HTS) en een groep van farmacologische chaperones die gered van het vervoer van de P23H rhodopsine van ER naar het plasmamembraan geïdentificeerd. Hier, met behulp van een methode van immunokleuring gevolgd door een hoge-inhoudsanalyse imaging, we de mutant rhodopsine eiwit bedrag in de hele cel en op het plasma-membraan gekwantificeerd. Deze methode is informatief en effectief te identificeren waar treffers van valse positieven na HTS. Bovendien, de hoge-inhoud beeldanalyse ons in staat gesteld te kwantificeren van meerdere parameters van een enkele experiment te evalueren van de farmacologische eigenschappen van elke stof. Met behulp van deze test, geanalyseerd wij het effect van 11 verschillende verbindingen naar zes RP verbonden rhodopsine mutanten, het verkrijgen van een 2D-farmacologische profiel voor een kwantitatieve en kwalitatieve inzicht over de structurele stabiliteit van deze rhodopsine mutanten en de werkzaamheid van verschillende verbindingen naar deze mutanten.
Introduction
Eiwit misfolding is betrokken bij spierdystrofie, neurale degenerations, evenals de verblindende ziekten, met inbegrip van retinitis pigmentosa (RP)1. RP is een overgenomen en Progressieve Retina degeneratie geassocieerd met mutaties in meer dan 60 genen beïnvloeden de functie en de homeostase van rod researchdieren of de retinale pigment epitheliums (RPEs)2,3. Geen effectieve behandeling is momenteel beschikbaar voor RP. Rodopsine mutaties zijn goed voor ongeveer 25-30% van autosomaal dominant (ad) RP gevallen. Onder de meer dan 150 rhodopsine mutaties4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), de klasse II-mutaties veroorzaken de structurele instabiliteit van de rhodopsine proteïne dat aan de staaf fotoreceptor dood bijdraagt en visie verlies5,6,7,8. De P23H is de meest voorkomende rhodopsine mutatie in Noord-Amerika, dat is ook een typisch voorbeeld van de klasse II rhodopsine mutaties9,10. Als gevolg van de inherente structurele instabiliteit, wordt de misfolded rhodopsine geaccumuleerd in het endoplasmatisch reticulum (ER) in zoogdiercellen, overwegende dat de wild type rhodopsine zich op het plasma-membraan5 bevindt. De misfolded rhodopsine P23H mutant exposities dominante negatieve cytotoxiciteit die is niet te wijten aan haploinsufficiency, maar is gerelateerd aan de activering van ER geassocieerde eiwit aantasting van het traject en de organisatie van de buitenste segment onderbroken staaf. Om te verlichten staaf fotoreceptor cel stress, is een strategie te stabiliseren de inheemse vouwen van de mutant rhodopsine met behulp van een farmacologische chaperon.
Om dit te bereiken, hebben we een cel-gebaseerde high-throughput scherm (HTSs)11,12,13 met behulp van een β-galactosidase fragment complementatie assay te kwantificeren van de P23H rhodopsine mutant vervoerd op het plasma uitgevoerd membraan. Het robuuste en eenvoudige protocol voor deze HTS-test konden we verkennen van de activiteiten van ongeveer 79.000 kleine molecules voor elk scherm. Echter omdat deze HTS-assay luminescentie signalen leest, zijn valse positieven, met inbegrip van de β-gal-remmers, gekleurde of cytotoxische stoffen opgenomen in de hit-lijst te wachten om te worden geïdentificeerd met een secundaire assay.
De traditionele immunokleuring en fluorescentie beeldvormende methoden zijn gebruikt voor jaren te bestuderen van het vervoer van rodopsine in zoogdiercellen5,14,15,16. Echter, deze conventionele methoden te kwantificeren farmacologische effecten van meer dan 10 verbindingen naar rhodopsine vervoer omdat een betrouwbare beeldvormende analyse vereist een groot aantal opnamen onder een zeer consistente voorwaarde, die kunnen niet worden gebruikt niet geamendeerd door de conventionele beeldvormende methoden. Hier, ontwikkelden we een immunokleuring gebaseerd high-inhoud imaging protocol als een secundaire assay te kwantificeren van de cel oppervlaktevervoer misfolded rhodopsine mutanten11,13,17. Om rhodopsine op het plasma-membraan van een label, overgeslagen we de stap van de celmembraan permeabilization en immunostained de mutanten rhodopsine door een monoclonal (B6-30) anti-rhodopsine herkennen van de N-terminale epitoop van rodopsine aan de extracellulaire kant van de cel membraan18. Om te visualiseren de mutant rhodopsine in de hele cel, gesmolten we rhodopsine met de Venus fluorescentie eiwit. Door de kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie in verschillende fluorescentie kanalen zijn wij in staat om meerdere parameters van één enkele experiment met inbegrip van de totale rhodopsine intensiteit in de hele cel op het celoppervlak, en de verhouding van Rodopsine fluorescentie op het celoppervlak aan die in de hele cel. Toepassing van deze methode om stabiele cellen uiten van een totaal van zes misfolded rhodopsine mutanten, we kunnen het genereren van een farmacologisch profiel van meerdere kleine molecuul chaperones naar deze mutanten. In dit protocol, alle cellen zijn immunostained in een 384-well-plate en beeld met behulp van een geautomatiseerd imaging systeem onder een zeer consistente imaging voorwaarde. Een beeldanalyse wordt uitgevoerd aan elk putje, met beelden van meer dan 600 cellen om variatie als gevolg van de heterogeniteit van de cellen met verschillende celniveau vorm en eiwit expressie. De workflow van dit protocol is samengevat in Figuur 1. Het voordeel van deze methode is dat we hoge resolutie beelden evenals Multi-parameter ondermeer uit het beeld-gebaseerde analyse krijgen. In het algemeen, kan dit protocol worden aangepast en toegepast om te kwantificeren van het vervoer van een misfolded membraan eiwit van belang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier, toonden we een hoge-inhoud imaging assay gebruikt voor het karakteriseren van hits geïdentificeerd van een HTS. De enige automatisering die betrokken zijn bij deze protocollen is de high-inhoud imager. De immunokleuring en fluorescentie beeldvorming van rodopsine zijn vaak gebruikt om het karakteriseren van de lokalisatie van rodopsine5,14,15,16. De kwantificering van de beelden genomen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Mark E. Schurdak en de Universiteit van Pittsburgh drugontdekking Instituut voor het verstrekken van de hoge-inhoud imager en de eerste trainingen. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) deelden genereus de 1 d-4 en B630 anti-rhodopsine antilichamen. Het plasmide met cDNA voor muis rhodopsine-Venus construct werd gedeeld door Dr. Nevin Lambert (Augusta University). Dit werk werd gesteund door het Nationaal Instituut van gezondheid subsidie EY024992 YC en P30EY008098 van de Universiteit van Pittsburgh Vision onderzoek Core subsidie.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
Referências
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Bioquímica. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
