Aqui, descrevemos um método de imagem de alto teor para quantificar o transporte dos mutantes rodopsina associado com retinite pigmentosa. Uma análise de múltiplos comprimentos de onda pontuação foi utilizada para quantificar proteína rodopsina na superfície da célula ou a célula inteira.
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Artigo de método
Um ensaio de transporte Rhodopsin por análise de imagem de alto teor
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mutações misfolding rodopsina levam à morte de fotorreceptoras de haste que se manifesta como autossômica dominante retinite pigmentosa (RP), uma progressiva cegueira doença que não tem tratamento eficaz. Nós hypothesize que a citotoxicidade do mutante rodopsina misfolded pode ser atenuada por farmacologicamente a estabilizar a proteína mutante rodopsina. A mutação P23H, entre as outras mutações de rodopsina de classe II, codifica uma proteína mutante rodopsina estruturalmente instável que é acumulada no retículo endoplasmático (ER), Considerando que a rodopsina tipo selvagem é transportada para a membrana plasmática em mamíferos células. Anteriormente realizamos uma tela de alta produtividade baseada em luminescência (HTS) e identificou um grupo de acompanhantes farmacológicas que resgatou o transporte da rodopsina P23H de ER para a membrana plasmática. Aqui, usando um método de imunocoloração seguido por uma análise de imagens de alto teor, podemos quantificar a quantidade de proteína mutante rodopsina na célula inteira e na membrana plasmática. Esse método é eficaz para identificar o verdadeiras correspondências a partir de falsos positivos após HTS e informativo Além disso, a análise de imagem de alto teor nos permitiu quantificar vários parâmetros de uma única experiência para avaliar as propriedades farmacológicas de cada composto. Usando este teste, analisamos o efeito de 11 diferentes compostos para seis RP associado rodopsina mutantes, obtendo um perfil farmacológico de 2-D para uma compreensão quantitativa e qualitativa sobre a estabilidade estrutural desses mutantes rodopsina e a eficácia de diferentes compostos para esses mutantes.
Introdução
Enrolamento de proteínas está envolvido na distrofia muscular, neurais Espinocerebelares, bem como doenças cegantes, incluindo retinite pigmentosa (RP)1. RP é uma degeneração da retina herdada e progressiva, associada com mutações em mais de 60 genes que afetam a função e a homeostase dos FOTORRECEPTORES de haste ou os epitélios pigmentado da retina (RPEs)2,3. Não há tratamento eficaz está atualmente disponível para RP. Rhodopsin mutações representam cerca de 25-30% de autossômica dominante (ad) casos RP. Entre os mais de 150 rodopsina mutações4....
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Protocolo
Nota: O rodopsina transporte ensaio.
1. preparação e cultura de células
- Reviva a crio-preservados U2OS estáveis celulas que expressam o tipo selvagem (WT) ou proteínas de fusão de rodopsina-Venus rato mutante. Descongele as células a 37 ° C, até que somente os cristais de gelo pequenos são deixados no frasco.
Nota: As células U2OS são utilizadas neste protocolo porque não há nenhuma linhagem de células fotorreceptoras disponível para estudos em vitro e pre-ciliar biossíntese de rodopsina é regulada por mecanismos moleculares similares em células de mamíferos. Além disso, as células U2OS anexar firmemen....
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Resultados
Caracteriza-se o transporte de rodopsina com três parâmetros: a intensidade da rodopsina-Venus na célula inteira (INT Rhodopsin-Venus), a intensidade de imunocoloração de rodopsina na membrana plasmática (rodopsina INT na superfície da célula) e a proporção de rodopsina mancha na superfície da célula, a intensidade de rodopsina-Venus na célula inteira (proporção de MEM-Total). Um resultado representativo do ensaio transporte rodopsina é mostrado na Figura 3 e.......
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Discussão
Aqui, nós mostramos um ensaio de alto teor de imagem usado para caracterizar sucessos identificados de um HTS A automação única envolvido nestes protocolos é o gerador de imagens de alto teor. A imunocoloração e imagem latente de fluorescência da rodopsina têm sido utilizados comumente para caracterizar a localização de rodopsina5,14,15,16. No entanto, a quantificação das imagens captadas pelos.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos o Dr. Mark E. Schurdak e Universidade de Pittsburgh Drug Discovery Institute para fornecer o sistema de imagem de alto teor e treinamentos iniciais. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) generosamente compartilhados B630 antianticorpos rodopsina e 4 a 1. O plasmídeo contendo o cDNA do rato rodopsina-Venus construção foi partilhado pelo Dr. Nevin Lambert (Universidade de Augusta). Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de saúde grant EY024992 YC e P30EY008098 de grant do núcleo de pesquisa de visão de Universidade de Pittsburgh.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células U2OS (rodopsina-Vênus) | NA | Células | estáveis geradas a partir de células U2OS |
| Células U2OS (T4R-rodopsina-Vênus) | NA | Células estáveis geradas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (P23H-rodopsina-Vênus) | NA | Células estáveis geradas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (P53R-rodopsina-Vênus) | NA | Células estáveis geradas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (C110Y-rodopsina-Vênus) | NA | NA | Células estáveis geradas a partir de células U2OS |
| Células U2OS (D190N-rodopsina-Vênus) | NA | Células estáveis geradas a partir de células U2OS | |
| Células U2OS (P267L-rodopsina-Vênus) | NA | Células estáveis geradas a partir de células U2OS | |
| DMEM glicose alta | Genesee Scientific | 25-500 | Com L-Glutamina, sódio piruvato |
| Soro fetal bovino (FBS) | Gibco | 16140071 | Plasmocin inativado por calor |
| InvivoGen | ant-mpt | Reagente de eliminação de micoplasma | |
| Penicilina-Estreptomicina (100X) | Gibco | 15140122 | 100X soluções antibióticas concentradas para prevenir a contaminação bacteriana de culturas celulares |
| Tripsina-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0,25%, EDTA 1mM em HBSS sem |
| solução de poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70.000-150.000, 0,01%, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura de células |
| Microplacas CellCarrier-384 Ultra | PerkinElmer | 6057300 | Microplacas tratadas com culto de tecido de 384 poços com paredes de poço preto e um fundo de olefina cíclica opticamente transparente para imagens de células em análise |
| de alto conteúdoPlaca estéril de 96 poços | Eppendorf | 30730119 | Cultura de tecidos tratada com tampa de fundo plano, estéril, livre de pirogênios detectáveis, Rnase, DNase e DNA. |
| Sailine Tamponada com Fosfato Não Citotóxico (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x Tampão PBS, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, testado em cultura de células |
| 9-cis-retinal | Compostos Sigma-Aldrich | R5754 | |
| testados | Selleckchem/Life Chemicals/Compostos NA sintetizados personalizados | foram comprados de diferentes fornecedores ou | |
| anticorpo anti-rodopsina B6-30 | Novus | NBP2-25160 | Presente do Dr. Krzysztof Palczewski |
| Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra conjugado Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldeído | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Sem metanol |
| 10% Soro de Cabra Normal | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Tampão de bloqueio |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Solução de coloração nuclear |
| Imager de alto conteúdo | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Sistema de imagem de alto conteúdo micro confocal |
| MetaXpress software de aquisição e análise de imagem de alto conteúdo | Molecular Devices | MetaXpress | Software de aquisição e análise de imagem de alto conteúdo |
| Pipeta multicanal (0,5-10 µ L) | Pipeta | manual de 8 canais Rainin 17013802 | 0.5-10 µ L |
| Pipeta multicanal (0,5-10c | Rainin | 17013805 | Pipeta manual de 8 canais, 20-200 e micro; L |
| Pipeta eletrônica multicanal (10-200 μ L) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Pipeta eletrônica multicanal para tarefas de pipetagem de microplacas de 96 e 384 poços |
| Reservatório de reagente de 50ml | Genesee Scientific | 28-125 | Reservior de reagente para dispensação de pippte multicanal |
| Aspirador de 8 canais | ABC Scientific | EV503 | Adaptador de aço inoxidável de 8 canais para aspiração de líquidos de placas de 96 ou 384 poços |
| Excel software de planilha | Microsoft | Excel2016 | O software de planilha para análise de dados e geração de mapa de calor |
| Origin2018 software de análise de dados científicos e gráficos | OriginLab | Origin2018 | O software de análise de dados para gerar as curvas de resposta à dose |
Referências
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. <....
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Reimpressões e permissões
