Un saggio di trasporto Rhodopsin dall'analisi di Imaging ad alto contenuto
Summary
Qui, abbiamo descritto un metodo di imaging ad alto contenuto per quantificare il trasporto dei mutanti di rodopsina associata alla retinite pigmentosa. Un’analisi dei punteggi multiplo-lunghezza d’onda è stata utilizzata per quantificare proteina rhodopsin sulla superficie delle cellule o in tutta la cella.
Abstract
Rodopsina misfolding di proteine mutazioni portano a morte dei fotorecettori asta che si manifesta come pigmentosa dominante autosomal di retinite (RP), una progressiva accecante malattia che manca di un trattamento efficace. Supponiamo che la citotossicità del mutante misfolded rodopsina possa essere alleviata stabilizzando farmacologicamente la proteina mutante rodopsina. La mutazione di P23H, tra le altre mutazioni di rodopsina di classe II, codifica per una proteina mutante di rodopsina strutturalmente instabile che viene accumulata nel reticolo endoplasmatico (ER), considerando che la rodopsina wild-type viene trasportata alla membrana plasmatica in mammiferi cellule. Precedentemente abbiamo effettuato una schermata di alto-rendimento basata su luminescenza (HTS) ed abbiamo identificato un gruppo di chaperoni farmacologici che hanno salvato il trasporto della rodopsina P23H da ER alla membrana plasmatica. Qui, utilizzando un metodo di immunostaining seguito da un’analisi di imaging ad alto contenuto, abbiamo quantificato la quantità di proteina mutante rodopsina in tutta la cella e sulla membrana plasmatica. Questo metodo è informativo ed efficace per identificare i veri successi da falsi positivi dopo HTS Inoltre, l’analisi di immagine ad alto contenuto permesso di quantificare i parametri multipli da un singolo esperimento per valutare le proprietà farmacologiche di ogni composto. Usando questa analisi, abbiamo analizzato l’effetto di 11 diversi composti verso sei mutanti di rodopsina RP associati, ottenendo un profilo farmacologico 2-D per una comprensione quantitativa e qualitativa circa la stabilità strutturale di questi mutanti di rodopsina e l’efficacia di diversi composti verso questi mutanti.
Introduction
Misfolding proteico è coinvolto nella distrofia muscolare, degenerazioni neurale, come pure malattie accecante, compresa la retinite pigmentosa (RP)1. RP è una degenerazione retinica ereditaria e progressiva associata a mutazioni in oltre 60 geni che influenzano la funzione e omeostasi dei fotoricettori dell’asta o l’epitelio pigmentato retinico (RPEs)2,3. Nessun trattamento efficace è attualmente disponibile per RP. Le mutazioni di rhodopsin rappresentano circa il 25-30% di autosomica dominante (ad) casi RP. Tra le mutazioni più di 150 del rhodopsin 4 i (Human Gene mutazione Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), le mutazioni di classe II causano l’instabilità strutturale della proteina rhodopsin che contribuisce alla morte dei fotorecettori rod e visione perdita5,6,7,8. Il P23H è la mutazione più frequente di rodopsina in Nord America, che è anche un tipico esempio della classe II rodopsina mutazioni9,10. A causa della sua intrinseca instabilità strutturale, la rodopsina misfolded viene accumulata nel reticolo endoplasmatico (ER) in cellule di mammifero, considerando che la rodopsina wild-type si trova sulla membrana plasmatica5. La rodopsina misfolded P23H Mostre mutante dominante citotossicità negativa che non è dovuto l’aploinsufficienza, ma è relativo all’attivazione di ER associati via di degradazione proteica e l’organizzazione del segmento esterno asta interrotta. Per alleviare stress cellulare di asta del fotoricettore, una strategia è quello di stabilizzare la piegatura nativo della rodopsina mutante usando un chaperone farmacologico.
Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo effettuato un basati su cellule di schermo di alto-rendimento (intasamento)11,12,13 usando un’analisi di complementazione frammento di β-galattosidasi per quantificare il mutante di rodopsina P23H trasportato sul plasma membrana. Il protocollo semplice e robusto di questo test HTS permesso di esplorare le attività di circa 79.000 piccole molecole per ogni schermo. Tuttavia, poiché questo test HTS legge segnali di luminescenza, falsi positivi, tra cui gli inibitori β-gallone, composti colorati o citotossici sono inclusi nella lista di colpo in attesa di essere identificato da un’analisi secondaria.
Il tradizionale immunostaining e metodi di formazione immagine di fluorescenza sono stati utilizzati per anni per studiare il trasporto di rodopsina in cellule di mammiferi5,14,15,16. Tuttavia, questi metodi convenzionali non possono essere utilizzati per quantificare gli effetti farmacologici di più di 10 composti verso trasporto rodopsina, perché un’analisi di imaging affidabile richiede un gran numero di immagini scattate in una condizione altamente coerenza, che è non modificabile dai metodi convenzionali di formazione immagine. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo di imaging ad alto contenuto di immunostaining basato come un’analisi secondaria per quantificare il trasporto su superficie delle cellule di rodopsina misfolded mutanti11,13,17. Per assegnare un’etichetta rodopsina sulla membrana plasmatica, abbiamo saltato il passo di permeabilizzazione della membrana cellulare e immunostained i mutanti di rodopsina da un monoclonale anti-rodopsina (B6-30), riconoscendo l’epitopo del N-terminale della rodopsina sul lato extracellulare della cella membrana18. Per visualizzare la rodopsina mutante in tutta la cella, abbiamo fuso rodopsina con la proteina di fluorescenza di Venus. La quantificazione delle intensità di fluorescenza in canali diversi di fluorescenza, siamo in grado di ottenere parametri multipli da un singolo esperimento tra cui l’intensità totale rodopsina in tutta la cella, sulla superficie delle cellule e il rapporto di fluorescenza di rodopsina sulla superficie delle cellule che in tutta la cella. Applicare questo metodo per stabile di cellule che esprimono un totale di sei mutanti misfolded rodopsina, possiamo generare un profilo farmacologico della più piccola molecola chaperoni verso questi mutanti. In questo protocollo, tutte le celle sono immunostained in una piastra 384 pozzetti e imaging utilizzando un sistema di imaging automatizzato in una condizione di imaging altamente coerenza. Un’analisi delle immagini viene eseguita in ciascun pozzetto, contenente immagini di più di 600 cellule per ridurre la variazione a causa dell’eterogeneità delle cellule con diversi livelli di espressione della proteina e della forma delle cellule. Il flusso di lavoro del presente protocollo è riassunto nella Figura 1. Il vantaggio di questo metodo è che otteniamo immagini ad alta risoluzione, nonché multi-parametro quantificazioni dall’analisi basata su immagini. In generale, questo protocollo può essere modificato e per quantificare il trasporto di qualsiasi proteina di membrana misfolded di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo mostrato un test di imaging ad alto contenuto utilizzato per la caratterizzazione di colpi identificati da un HTS L’automazione solo coinvolti in questi protocolli è il dispositivo di imaging ad alto contenuto. Il immunostaining e formazione immagine di fluorescenza del rhodopsin sono stati utilizzati comunemente per caratterizzare la localizzazione di rodopsina5,14,15,16. Tuttavi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringraziano il Dr. Mark E. Schurdak e Università di Pittsburgh Drug Discovery Institute per fornire il dispositivo di imaging ad alto contenuto e corsi di formazione iniziale. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) ha generosamente condiviso la 1D4 e anticorpi anti-rodopsina B630. Il plasmide contenente il cDNA di mouse rodopsina-Venus costrutto è stato condiviso da Dr. Nevin Lambert (Università di Augusta). Questo lavoro è stato supportato dall’Istituto nazionale di sovvenzione di salute EY024992 a YC e P30EY008098 da grant Università di Pittsburgh Vision Research Core.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
Referências
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