Родопсин транспорта пробирного анализа изображений высоким содержанием
Summary
Здесь мы описали высоким содержанием изображений метод количественной оценки транспорта родопсин мутантов, связанные с пигментный ретинит. Несколько волны скоринга анализ был использован для количественного определения родопсин белка на поверхности клеток или всю ячейку.
Abstract
Родопсин сворачиванию мутации приводят к смерти фоторецепторных стержня, которая проявляется как аутосомно-доминирующей пигментный ретинит (RP), прогрессивной ослепляющий болезнью, что не хватает эффективного лечения. Мы предполагаем, что цитотоксичность смятых родопсин мутант могут быть решены путем фармакологически стабилизации мутант родопсин белка. P23H мутации, среди других мутации родопсин II класса, кодирует структурно нестабильной родопсин Мутантный белок, который накапливается в эндоплазматический ретикулум (ER), тогда как дикого типа родопсин транспортируется к плазматической мембране в млекопитающих клетки. Мы ранее выполнена на основе свечения экрана высок объём (HTS) и определили группу фармакологической сопровождающих, которые спасли транспорта P23H родопсина из ER к плазматической мембраны. Здесь мы с помощью метода иммуноокрашивания следуют изображений высокой контент-анализа, количественно мутант родопсин белка сумма в клеточных и на плазматической мембраны. Этот метод является эффективным для определения истинной хиты от ложных срабатываний, после Хайтс и информативным Кроме того анализ изображений высоким содержанием позволили нам определить несколько параметров из одного эксперимента оценить фармакологических свойств каждого соединения. С помощью этого анализа, мы проанализировали влияние 11 различных соединений к шести RP связанные родопсин мутантов, получение 2-D фармакологические профиль для количественного и качественного понимания о структурной стабильности этих мутантов родопсин и эффективность различных соединений к этих мутантов.
Introduction
Сворачиванию белков участвует в мышечной дистрофии, нейронной дегенерации, а также ослепляющего заболеваний, включая пигментный ретинит (RP)1. RP-это унаследованные и прогрессивного дегенерация сетчатки, связанных с мутациями в более чем 60 гены, влияющие на функции и гомеостаза стержня фоторецепторов или пигментированной сетчатки epitheliums (RPEs)2,3. Без эффективного лечения в настоящее время доступна для RP. Родопсин мутации приходится около 25-30% аутосомно-доминанта (ad) RP случаев. Среди более чем 150 родопсин мутации4 (человека ген мутации база данных http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), класс II мутации вызывают структурной нестабильность родопсин белок, который способствует стержень фоторецепторных смерти и зрение потери5,6,,78. P23H является наиболее частые мутацией родопсин в Северной Америке, который также является типичным примером класса II родопсин мутации9,10. Из-за присущего структурная нестабильность смятых родопсин накапливается в эндоплазматический ретикулум (ER) в клетках млекопитающих, тогда как родопсин дикого типа расположен на плазматической мембране5. Протеолиз родопсин P23H мутант экспонатов доминирующей негативные цитотоксичность, что не из-за haploinsufficiency, но связано с активацией ER связанные пути деградации белка и организации внешнего сегмента Прерванный стержня. Для облегчения стержень фоторецепторных клеток стресс, одна из стратегий заключается в стабилизации родной складывания мутант родопсина, используя фармакологические сопровождающий.
Для достижения этой цели, мы провели на основе ячеек высок объём экран (HTSs)11,12,13 с помощью анализа взаимодополняемости фрагмент β-галактозидазы для количественного определения мутант P23H родопсина, перевозимых на плазму мембрана. Надежный и простой протокол этот assay HTS позволило нам изучить деятельность около 79000 малых молекул для каждого экрана. Однако потому что этот assay HTS читает свечения сигналов, ложных срабатываний, включая ингибиторов β-Гал, цветные или цитотоксические соединений включены в хит список ожидающих быть идентифицирован вторичного анализа.
Традиционные иммуноокрашивания и флуоресценции тепловизионные методы использовались для лет для изучения родопсин транспорт в mammalian клеток5,14,,1516. Однако эти традиционные методы не может использоваться для количественного определения фармакологические эффекты более 10 соединений к родопсин транспорта, потому что надежный анализ изображений требуется большое количество изображений, снятых при условии высокой согласованностью, который является не исправимый традиционными методами обработки изображений. Здесь мы разработали на основе иммуноокрашивания высоким содержанием визуализации протокола как вторичного анализа для количественного определения клеток поверхности транспорта смятых родопсин мутантов11,13,17. Для обозначения родопсин на плазматической мембране, мы пропущен шаг permeabilization клеточной мембраны и immunostained родопсина мутантов моноклональных анти родопсина (B6-30), признавая N-терминальный epitope родопсина на внеклеточные стороне ячейки мембрана18. Чтобы визуализировать мутант родопсин всю ячейку, мы сплавили родопсин с Венеры флуоресцирование белками. По количественной оценки интенсивности флуоресценции в каналах различных флуоресцирования мы в состоянии получить несколько параметров из одного одного эксперимента, включая общее родопсин интенсивности в целом ячейке, на поверхности клеток и соотношение Родопсин флуоресцирования на поверхности клеток, в целом ячейке. Применяя этот метод, чтобы стабильные клетки, выражая в общей сложности шести смятых родопсин мутантов, мы можем создать профиль фармакологических нескольких сопровождающих малые молекулы к этих мутантов. В этом протоколе все клетки immunostained в пластине 384-Ну и образы с использованием автоматизированной системы обработки изображений под условие весьма последовательной обработки изображений. Анализ изображений выполняется для каждой скважины, содержащие изображения более чем 600 клеток, чтобы уменьшить вариации из-за гетерогенности клеток с различной клетки форму и белка выражение уровня. Процесс этот протокол приводится на рисунке 1. Преимуществом этого метода является, что мы получить изображения с высоким разрешением, а также количественной Многопараметрический от анализа на основе образа. В общем этот протокол может быть модифицировать и применять для количественного определения перевозки любой смятых мембраной протеина интереса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы показали высоким содержанием изображений пробирного используется для квалификации хитов от Хайтс Только автоматизации, участвующих в этих протоколах является высоким содержанием томографа. Иммуноокрашивания и флуоресценции изображений родопсина обычно используются харак…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Марк э. Schurdak и обнаружения наркотиков университета Питтсбурга институт высоким содержанием тепловизор и начального обучения. Д-р Krzysztof Palczewski (Университет Кейс Вестерн Резерв) щедро поделился 4 1 d и B630 антитела анти родопсина. Плазмиды, содержащие cDNA мыши родопсин Венера конструкции разделяют доктор Невин Ламберт (Augusta университет). Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грант EY024992 ус и P30EY008098 из Питтсбургского университета видение исследования основных грант.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
Referências
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Bioquímica. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., Sittampalam, G. S. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. , (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
