Summary
小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞, 随着环境变化的形态变化而迅速反应。该协议描述了如何使用双光子显微镜研究微胶质过程对血清素或 atp 的吸引力, 在急性脑切片的小鼠。
Abstract
微胶质细胞是大脑中的固有免疫细胞, 它们在长时间的过程中不断地扫描它们的环境, 并在破坏稳态时经历快速的形态变化。例如, 激光病变在几分钟内诱导一个定向的微胶质过程的生长, 也被称为 "定向动力", 向受伤部位。通过局部 atp 或血清素 (5-羟基色胺 [5-ht]), 也可以获得类似的效果。在本文中, 我们描述了一种方案, 以诱导微胶质过程的定向生长, 向局部应用 atp 或5-ht 在急性脑片的急性脑片的年轻和成年小鼠, 并通过多光子显微镜图像这种吸引力随着时间的推移。提出了一种利用自由和开源图像分析软件进行量化的简单方法。急性脑片的一个特点仍然是时间有限, 随着年龄的推移而减少, 在此期间, 细胞保持生理状态。因此, 该协议强调了一些技术改进 (介质、气液界面室、双灌注成像室), 旨在在几个小时内优化微胶质细胞的活力, 特别是在成年小鼠的切片中。
Introduction
微胶质细胞是大脑的巨噬细胞, 在生理和病理条件 1,2中都起着一定的作用.它们具有高度分枝的形态, 并不断扩展和收缩其过程3,4。这种 "扫描" 行为被认为与对周围环境的调查有关, 也是必要的。微胶质细胞的形态可塑性以三种模式表示。首先, 一些化合物迅速调节微胶质细胞的形态: 在中浴急性脑片中加入 atp5、6或 nmda5, 7 增加了微胶质细胞影响的复杂性,而去甲肾上腺素会降低它 6。这些效应要么是由微胶质受体 (atp 和去甲肾上腺素) 直接介导的, 要么是需要神经元的 atp 释放 (对于 nmda)。第二, 微胶质过程的生长和收缩速度, 称为 "动力或监视", 可以受到细胞外因子8, 稳态中断9,10,或突变9, 10,11。第三, 除了这些各向同性的形态和动力的变化, 微胶质细胞有能力将其过程定向扩展到提供 atp3,5,12的移液器,13,14、在培养中、在急性脑片或体内, 或在急性脑片15中提供5-ht。这种微胶质过程的定向生长, 也被称为定向运动, 首先被描述为对局部激光病变3,4的反应。因此, 从生理上讲, 它可能与受伤的反应有关, 也可能与针对微胶质过程的目标, 以突触或大脑区域为目标, 在发育15、16或生理上17需要修剪 ,18,19或病理情况9,18,19,20在成年。三种类型的形态变化依赖于不同的细胞内机制11,13, 20 和一个给定的化合物不一定调节所有这些机制 (例如, nmda, 间接作用于微胶质细胞, 对形态有影响, 但不会引起方向动力5,7)。因此, 当目标是表征化合物、突变或病理对微胶质细胞的影响时, 重要的是要表征其形态可塑性的三个组成部分。在这里, 我们描述了一种方法来研究微胶质过程的定向生长向一个局部来源的化合物, 这是, 在这里, atp 或5-ht。
研究微胶质细胞过程吸引力的模型有几个: 三维环境中的初级培养 6、18、19、急性大脑切片 6、13、15和体内成像3,13。体内入路是保存微胶质细胞生理状态的最佳方法。然而, 深部区域的宫内成像需要复杂的外科手术, 因此, 它往往被限制在浅层皮质层。使用微胶质原代培养是用数量有限的动物测试大量条件的最简单的技术。然而, 它是不可能获得相同的细胞形态在体内, 细胞失去其与神经元和星形胶质细胞的生理相互作用。急性脑片代表了这两种方法之间的妥协。该模型允许研究人员研究在体内难以到达的大脑结构和高分辨率的图像, 并从新生儿阶段的切片进行研究, 而经颅显微镜主要是在成年时进行的。最后, 可以实时观察局部药物应用的效果, 并在使用数量有限的动物的同时重复实验。然而, 急性脑片的一个问题是细胞存活的时间有限 (几个小时), 特别是两周以上小鼠的切片, 以及随着时间的推移, 微胶质细胞形态可能发生变化.
在这里, 我们描述了一个方案, 以准备急性脑片的年轻和成人 cx3cr1gfp/c + 小鼠长达两个月大, 保持微胶质的形态和运动几个小时。然后, 我们描述如何使用这些切片来研究微胶质过程对 atp 或5-ht 等化合物的吸引力。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验都得到了地方道德委员会 (达尔文委员会、协议 #1170 和 #10921) 的批准。
1. 用于局部应用的玻璃微管的制备
- 用电极拉拔器从硼硅酸盐薄壁玻璃毛细管中准备移液器。调整参数以获得在其末端直径为4-5 微米的移液器。图 2d显示了一个低放大倍率的明亮场移液器。
2. 解决方案
- 确保只使用通过高压灭菌器循环清洗过的玻璃器皿, 然后用超纯水冲洗 2x-1 x。切勿使用与甲醛接触过的玻璃器皿。
-
准备一个2摩尔·l-1 ccl 2 库存溶液通过溶解14.7 毫克的 ccl2·2o在50 毫升的高纯度水 (超纯水, 电阻 18.2 mL; 蒸馏水或自来水中的金属痕迹可以导致亚优的切片质量, 由于促进氧化作用)。
- 将此库存解决方案存放在室温下, 最长一个月。
-
在实验当天, 准备1升胆碱-acsf (人工脑脊液) 溶液, 其成分为 110 mmol·l-1胆碱 cl, 25 mmol·l-1葡萄糖, 25 mmol·l-1纳哈科3, 7 mmol·l-1 mgcl2, 11.6 mmol·l-1抗坏血酸, 3.1 mmol·l-1丙酮酸钠, 2.5 mmol·l-1 kcl, 1.25 mmol·l-1 nah2po4和 0.5 mmol·l-1 ccl2, 0.5。
- 要准备此溶液, 请按以下顺序在1升级瓶中添加: 0.186 克 kcl、0.186 g nah2 po 4、2.04 g酸性抗坏血酸、2.1 克 nahco3和 4.5 g 葡萄糖.
- 用超纯水填充约一半的最终体积, 搅拌至完全溶解。
- 加入0.34 克丙酮酸钠和15.36 克胆碱 cl。
注: 在将胆碱溶液添加到整个溶液中之前, 先将其溶解2.3.2 步骤制备的溶液为5至10毫升, 是方便的。 - 添加7毫升1摩尔·l-1 mgcl2和250μl 的2摩尔·l-1 ccl2 (在步骤2.2 中准备) 到溶液中。
- 用超纯水填充刻度瓶, 最高可达1升。
- 使用蒸汽压力渗透计, 检查渗透度是否在300和 310 mω之间。如果没有, 用葡萄糖调整。
- 检查碳化后的 ph 值 (即, 用 "碳原" 冒泡, 混合 95% o 2/5% co2), 并在必要时将其调整为7.3-7.4 和 10 m naoh。
- 将溶液转移到玻璃瓶上存放。将瓶子放在冰箱中, 直至使用 (step 3.1)。
请注意:建议在实验当天做一个新的溶液。但是, 如有必要, 胆碱-csf 可在4°c 下存储长达两天。
-
在实验当天, 准备一个 acsf 溶液的 1 l, 其组成是 124 mmol·l-1氯化钠, 26.2 mmol·l-1 纳哈科 3, 25 mmol·l-1葡萄糖, 2.5 mmol·l-1 kcl, 2 mmol·l-1 ccl2, 1 mmol·l-1 mgcl2和 1.25 mmol·l-1 nah2po 4。
- 为了准备这种解决方案, 在刻度瓶中添加以下顺序: 0.150 克的 nah2 po 4、0.150克的 kcl、2.2 克的 nahco3、4.5 g 的葡萄糖和7.3 克的 nocl。将溶液带到1升的超纯水中, 并在搅拌板上大力搅拌。
- 添加1毫升1摩尔·l-1 mgcl2和 1 ml 2 mol ·l-1 ccl2到溶液中, 并将 acsf 溶液转移到玻璃瓶中存放。
- 检查渗透度是否为 300-310 mω·l-1 , 如果没有, 则用葡萄糖调整。
- 检查加气后的 ph 值 (即, 用 "加气原" 冒泡), 并在必要时将其调整为 7.3-7.4, 并使用 10 m naoh。
- 将溶液转移到玻璃瓶上存放。将瓶子放在冰箱里, 直到使用 (步骤 3.1)。
请注意:建议在实验当天做一个新的溶液。然而, 另一种方法是在最终浓度的10倍处制备含有氯化钠、nhco3、kcl 和 nah2po 4的10倍库存溶液, 在4°c 下可储存不超过一周。在实验当天, 通过用水稀释10倍的库存溶液, 加入葡萄糖、ccl2和 mgcl2, 进行最后的 ccsf。
- 在实验当天准备药物溶液。使用 acsf 溶液将它们带到最终浓度, 在这里, 500μmol·l-1为 atp 和5μmol·l-1为5-ht。
请注意:对于 atp, 可以制备库存溶液 (例如, 水中 50 mm atp), 以-20°c 的化名形式储存, 并在实验当天用 csf 稀释到最终浓度。相反, 5-ht (血清素-hcl) 溶液必须在实验当天用粉末制备, 在水中为 1 mg·ml-1, 保持在 4°c, 以避免5-ht 氧化, 并在实验时在 acsf 中稀释.
3. 急性脑片的制备
-
解剖区域的准备
- 准备70毫升的冰凉胆碱-抗脑脊液在一个80毫升的烧杯放置在冰上, 用于心脏灌注, 大脑的快速冷却, 和切片。准备150毫升的胆碱-抗 unsf 在一个200毫升的结晶盘, 放置在一个加热的水浴, 保持在32°c。在结晶盘中放置尼龙网过滤器以保留切片。这将用于让切片在切片后恢复10分钟。
- 在开始解剖之前至少 30分钟 (3.2 节), 开始用碳原泡泡这两种溶液 (冰上的胆碱-胆碱-csf 70 毫升和胆碱-csf 150 毫升)。在整个过程中保持持续的碳化。
- 准备接口腔设备 (图 1c), 该装置将用于保存切片, 直到它们使用。
- 安装在磁性搅拌器上的密封食品盒 (直径 10 x 10 厘米或10厘米, 高度8厘米) 中, 将 200 ml 结晶盘与棒状磁铁放在一起。
- 在这个结晶盘中添加200毫升的 acsf, 并将3d 打印的接口片支架放在其顶部 (接口切片支架由两个完美拟合的部分组成, 它们之间有一个聚酰胺网格,图 1a. b).
- 从结晶盘中去除多余的体积, 以便只保留一层薄薄的溶液, 覆盖界面片支架的网格。这将在以后围绕切片创建一个很好的解决方案边缘 (但不覆盖它们)。
- 在食品盒底部放几毫米的 acsf, 开始用碳原起泡 (第一次使用时, 在密封的食品盒壁上打一个小孔, 以确保管材能够进入盒子)。
- 关闭密封盒, 同时保持恒定的加气。这将创建一个加湿 95% o2/5% 二氧化碳丰富的环境, 其中切片将转移后, 他们恢复在胆碱-csf 和维护之前, 他们被成像之前.此设备以下简称 "接口室" (图 1c)。
-
脑解剖和切片
- 用50毫克·ml-1 五巴比妥 (小鼠体重 0.15 ml/2 g)的腹腔内注射麻醉小鼠, 固定它, 暴露心脏, 并用10毫升的冰凉、加气、胆碱-acsf 进行心脏灌注 (见步骤)3.1.1), 用蠕动泵。观察肝脏的苍白, 作为一个良好的灌注的指标。灌注持续不到5分钟。
- 将鼠标斩首, 并切割皮肤以暴露头骨。用大剪刀, 从大孔和一个长的矢状切口应用两个横向切割, 并使用精细的钳子, 删除头骨板。
- 快速和轻轻地提取大脑 (不到 1分钟), 并将其放置在80毫升烧杯中 1分钟, 其中含有剩余的 (~ 60 毫升) 冰凉的胆碱-胆碱-csf (仍在持续的加气下), 以便将其冷却。
- 将大脑转移到以前用 csf 湿的滤纸上。
- 根据大脑感兴趣的区域和首选的切片角度切掉大脑。例如, 要在日冕切片上对丘脑或海马体进行成像, 用手术刀将小脑切掉, 然后, 从大脑的根和尾端大约2毫米。
请注意:重要的是要删除大脑中过于倾向或过于尾端的部分, 因为在到达感兴趣的区域之前, 要修剪的区域越小, 切片速度就越快。建议将切片 (步骤 3.2.7) 的总时间小于20分钟。 - 对于日冕切片, 位置和胶水 (与氰基丙烯酸酯胶) 大脑的尾端面到一个10厘米的培养皿, 粘在振动切片器的切割块上, 并将其放置在振动切片器的储罐中, 该腔位于较大的腔中充满了冰。然后, 在培养皿中充满所有剩余的冰凉胆碱-抗 csf。
- 在保持恒定的 95% o 2/5% co2 冒泡的冰凉胆碱-acsf, 削减300μm 厚的冠状片 (速度: 0.08 m·s-1, 叶片振动:60 赫兹, 振动振幅: 1 毫米).
- 用宽口 (直径4毫米) 一次性输送移液器收集大脑切片, 每次一次接一个地通过刀片, 以避免切片外围释放的有毒成分的积累。注意避免在转移过程中出现气泡, 并在32°c 的胆肠-反核细胞中放置每片, 约 10分钟, 以便恢复。
- 通过转移移液器, 将切片放在镜头清洗纸上, 上面有一滴胆碱-抗脑脊液。吸收过量的胆碱-抗 csf, 并与铲子一起, 将放置在镜片清洁组织上的切片, 放在含有加压性 acsf 的界面室的网格上 (见 3.1.3.5)。让切片在此环境中恢复至少30分钟。
请注意:之后, 切片已准备就绪, 可用于大脑从年轻 (不到一个月) 小鼠身上提取后6小时的微胶质细胞成像, 以及从2个月大的成年人身上提取大脑后长达4小时的微胶质细胞成像。
4. 双光子显微镜
- 参数设置
- 打开多光子系统 (混合探测器、激光、扫描仪、电光调制器、显微镜)。
- 将激光调整为920纳米, 检查激光是否锁模, 并将功率设置为 5%-15%, 增益设置为10%。这对应于目标下的 3-5 mw 的功率。确保采用非脱罐探测器, 并安装适当的排放和励磁过滤器。
- 将成像软件的参数设置为以下值: 对于帧大小, 1024 x 1024 像素对应于 295.07 x 295.07 微米的面积;为变焦, 2。如果信号非常嘈杂, 则应用平均为2的线。对于像素动态, 将成像软件设置为12位或更小。
请注意:比特值较高的图像使研究人员能够区分比具有较低位值的图像更小的荧光强度差异: 8位图像中一个灰度值的变化将对应于12位中16个灰度值和256个灰度值 i 的更改n 16位图像。因此, 较高的位图像更适合于定量分析, 但随着位深度、存储容量和计算能力的增加, 它们的大小可能会变得有限。 - 选择 z 间隔范围为2μm、t 间隔为2分钟的扫描模式 xyzt。
请注意:x、y 和 z 分辨率由尼奎斯特采样定理确定。z 步长约0.8 将是解决微胶质化过程 (直径为 lt;1 微米) 的最佳选择, 但多光子显微镜的光学分辨率是有限的 (在920纳米, 具有 0.95 na 目标时, 轴向分辨率约为 1μm)。在物理屏障的基础上, 在实时成像实验中, 灵敏度或信噪比、分辨率、速度和总观测时间都很重要。考虑到所有这些参数, 2μm 的 z 步 (如许多研究3、11、14)、1024 x 1024 像素的图像大小以及使用与 hyd 探测器耦合的谐振扫描仪进行高速采集 (需要大约15秒获得 50 z 计划) 在这里被选中。采集频率为每2分钟一个 xyzt 系列, 总持续时间为30分钟。如果设置不够快或不够敏感, 则可以将横向分辨率 (下降到 512 x 512) 或 z 切片数 (仅在显示最强荧光的 z 深度进行成像) [即,而不是最深的 z 片。荧光微弱)), 或降低扫描仪的速度。轴向分辨率也可以通过将 z 步长增加到3μm 来降低, 但由于这可能会影响量化, 因此所有要比较的实验都应使用相同的 z 步长进行。
请注意:可以对 cx3cr1creer-yfp小鼠 18的切片进行类似的实验, 这是一种仅用于诱导微胶质细胞遗传缺失的小鼠系, 在这种小白细胞中, 微胶质细胞本构表达黄色荧光蛋白 (yfp)。然而, 与绿色荧光蛋白 (gfp) 相比, yfp 在 cx3cr1gfp/c + 小鼠中的表达水平很低;因此, 成像是可能的, 但具有挑战性, 需要优化采集参数。建议按如下方式调整它们。 - 将激光调整为 970 nm (比970纳米更适合 yfp 激发), 功率为 50%, 增益为 50%, 这对应于 5-6 mw 目标下的激光功率。
- 设置 4 (或更多) 的线平均值, 以提高信噪比。
- 切片和玻璃微移液器的定位及化合物的局部应用
- 将蠕动泵连接到记录室, 30分钟后才开始录音。用50毫升的超纯水清洗整个灌注系统后, 在不断的碳化条件下, 用玻璃烧杯中包含的 acsf (50 毫升) 开始记录室的灌注。在整个实验过程中, 使用内联微加热器或 peltier 加热器将循环 acsf 保持在32°c。
请注意:设计了一种具有顶部和底部灌注的特定灌注室, 以优化切片两侧的氧合。灌注室由两个完美拟合的部分组成, 它们之间拉伸了一个聚酰胺网 (图 2a. b)。与其他类型的室相比, 切片直接放置在玻璃覆盖板上, 这个腔体减少了切片底部的神经元死亡, 提高了生存能力, 并减少了其肿胀引起的切片运动。 - 使用广口一次性转移移液器, 将被成像的大脑切片转移到 acsf 烧杯上, 以取出镜头纸, 让它下沉 (作为没有气泡连接的证据), 并将其转移到记录 (灌注) 室。
- 将切片支架 (由铂金制成的发夹, 由两个分支由平行尼龙螺纹连接) 放置在切片上, 以最大限度地减少由于灌注流而导致的切片运动。
- 使用明亮的字段照明, 使用低放大倍率目标 (5倍或 10倍), 以目标定位感兴趣的大脑区域 (曝光时间:50 至80毫秒)。切换到较高的放大倍率 (25 x 与 0.35 x 镜头) 水浸没目标, 并调整位置。
请注意:避免将图像字段靠近切片支架的尼龙线, 因为它们会阻挡光线并在本地变形切片。确保感兴趣的区域是平坦的。如有必要, 请取出切片支架, 以便重新定位切片和/或切片支架。 - 使用荧光照明定位要在野外成像的荧光微胶质细胞 (曝光时间: 250-500 毫秒)。
请注意:这一步使研究人员能够检查感兴趣区域中是否存在细胞及其荧光强度, 并控制细胞碎片的数量。 - 用 atp、5-ht 或最后浓度感兴趣的药物将移液器填充10μl 的 acsf。将尖端向下, 轻轻摇晃充满毒品的移液器, 以去除任何被困在尖端的气泡。
请注意:如果要注入的溶液倾向于形成气泡, 请考虑使用带有内部灯丝的硼硅酸盐移液器。即使在注射之前, atp 从移液器中泄漏也会吸引微胶质过程 (如果发生这种情况, 在分析步骤中就会可见)。虽然这应该是适度的以 atp 浓度使用 (500μmol ·l-1), 如果有问题, 请考虑在步骤4.2.6 上添加 atp (或其他化合物) 溶液之前, 先将微移液器预填2毫升的 acsf。 - 将填充的移液器安装在移液器支架中, 用透明的管道连接到5毫升注射器上, 柱塞位于5毫升位置。移液器支架本身安装在一个三轴微型机械手上。
- 在明亮的字段照明下, 使用微机械手将移液器放置在场的中心。要获得可重现和最佳的居中, 请显示和使用图像上的标尺。
- 将移液器轻轻朝切片下, 同时控制和调整目标, 直到移液器尖端轻轻接触到切片表面。一旦看到所接触的切片, 就停止移液器的下降, 使移液器尖端能够穿透切片表面的80-100 微米 (见图 3b)。
- 调整激光 (请参见上面的参数), 并将显微镜切换到多光子模式。确保从任何光源 (例如计算机屏幕) 对腔体进行屏蔽。打开非脱壳探测器并设置增益。使用带有颜色编码上限的查找表 (lut), 以避免图像中的像素饱和。
- 确定要成像的切片的厚度 (即可检测荧光的上、下 z 位置 [通常在220至290微米之间])。
请注意:在切片的表面, 与切片的内部相比, 过程的密度增加, 可能还有微胶质细胞的密度, 通常具有不寻常的形态。随着时间的推移, 这种积累将更加引人注目(即在最后一个过程中比在第一个被成像的大脑切片中更明显)。因此, 在前 ~ 30μm 中的 z 平面不应用于分析, 甚至可以跳过进行采集。 - 开始记录总持续时间为 30分钟 (或更多 (如果需要), 并在5分钟基线之后, 在本地应用要测试的化合物 (不中断成像)。为此, 请慢慢按下连接到微移液器的注射器柱塞, 从5毫升到 1 ml 位置 (约 5秒)。按压柱塞时必须立即感觉到阻力。否则, 提示可能会被破坏。
请注意:对于受过训练的实验者, 这种方法的注射是可重复的, 但对于注射器的手动操作, 移液器可以连接到自动压力喷射系统, 以便更好地控制交付的体积。注射在注射部位会造成切片的物理变形。这种失真在注射后的前两到三个图像中是后验可见的, 但在第四张图像上不应可见, 即注射后 8分钟)。如果它仍然存在, 请考虑更改移液器制备的参数。 - 在采集结束时 (30分钟), 丢弃微移液器并取出切片。如果需要, 请修复切片以进一步进行免疫标记。例如, 通过对星期日拍摄方法进行了优化, 以确定和染色厚片 23。
- 在开始拍摄新切片之前, 制作2d 影片 (第5.1 节), 以检查微胶质细胞是否具有正常形态并正在移动, 从而确保切片正常运行。
- 将蠕动泵连接到记录室, 30分钟后才开始录音。用50毫升的超纯水清洗整个灌注系统后, 在不断的碳化条件下, 用玻璃烧杯中包含的 acsf (50 毫升) 开始记录室的灌注。在整个实验过程中, 使用内联微加热器或 peltier 加热器将循环 acsf 保持在32°c。
5. 微胶质过程吸引力分析
-
二维投影和漂移校正
- 打开该文件 (。lif) 与斐济24。
- 如有必要, 仅使用感兴趣的 z 平面进行子堆栈 (image\ stacks\ tootss自身)。例如, 如果已获取与切片表面相对应的 z 平面, 但不用于分析 (请参阅4.2.11 的说明) 和没有荧光的最深 z 平面。最终堆栈通常包含 90-110 z 片 (180-220 微米)。
- 启动z 项目函数 (image/stacksssz 项目"), 并选择"最大强度投影类型 ", 以使在每个时间点获得的 z 堆栈的投影。
- 启动"多斯塔克瑞格" 插件(插件/注册/多堆叠), 选择"操作 1: 对齐和转换: 刚体" 以纠正在采集过程中可能发生的轻微漂移。将此2d 影片另存为新文件 (. tiff)。
-
数据处理
- 打开这个新文件与 "冰25"。
- 绘制直径为35μm 的圆形r1感兴趣区域 (roi), 以注射部位为中心 (主要由移液器的阴影和注射时产生的变形来识别)。
- 使用插件roi 强度演化,测量 r1 中的平均强度。
- 将结果保存到。文件。
-
结果的量化和表示
- 要量化随着时间的推移的微胶质反应, 确定在每个时间点
Here,'R1(0) 是注入前 R1(t) 值的平均值。然后, 结果可以表示为微胶质反应的动力学, 也可以表示为特定时间点 (见图 7)。
- 要量化随着时间的推移的微胶质反应, 确定在每个时间点
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议描述了一种方法, 以诱导, 观察和量化定向生长的微胶质过程向局部应用的化合物, 例如 atp 或 5-ht, 急性脑切片从年轻或成人 (至少两个月) 小鼠。在有助于将成年动物的大脑切片保持在健康状态数小时的因素中, 使用了两个工具, 旨在在协议的两个步骤中优化细胞存活率。首先, 接口腔中的界面片支架 (图 1) 改善了切割后切片的保存。其次, 记录室 (图 2) 有一个灌注系统, 允许 acsf 在成像过程中在切片的顶部和底部运行。这里使用的记录室尺寸设置为适合标准显微镜, 因为它们类似于传统的浴室刀片 (外径为62毫米), 但由于其型号可从补充材料下载, 设计可以适用于其他尺寸的切片支架。需要注意的是, 每个室都是由两个完美拟合的部件组成的组件, 没有胶水, 它们之间有一个聚酰胺网格。
为了在较小的区域内输送 atp 或 5-ht, 并诱导微胶质细胞的局部反应, 在片顶放置一个含有该化合物的移液器 (如图 2c, d可见)。在第一个实验中, 在溶液中添加荧光染料可能会很有帮助, 以便在使用双光子显微镜获得的图像上可视化移液器尖端的位置 (图 3 a)。在图3b 中, 可以看出, 尽管实验者在移液器的尖端接触并变形了计算机屏幕上的明亮场图像上的切片表面时, 但其薄薄的四肢稍微进入组织, 下降到 80-从表面100微米。重要的是, 移液器不要太肤浅, 因为它可能无法将溶液正确地传递到细胞上, 也不会进入太深, 因为它可能到达荧光信号太低的区域。可能影响移液器尖端深度的参数是移液器的角度 (可通过三轴微机械手进行调整) 和移液器口直径。
请注意, 当投影沿 y 轴 (图 3b) 时, 可以观察到, 在上部比在切片的下部荧光强。这既是由于切片内信号的逐渐减弱, 也是由于切片表面层的微胶质细胞的过程以及一些细胞体的过程往往向表面迁移。因此, 切片最浅层的微胶质细胞可能表现出与切片内不同的形态, 表明它们不处于同一状态, 并且可能对刺激反应不同。因此, 表面的微胶质细胞激活可能掩盖, 在 z 投影, 下面的微胶质细胞的反应。此外, 表面经常倾斜, 堆栈的第一批 z 图像是杂乱无章的。因此, 为了获得更好的精度, 我们建议将最肤浅的 z 平面排除在 z 投影和分析之外。然而, 由于改变后的微胶质细胞形态和表面层中碎片的存在是切片状况的指标, 因此可以很有趣地将切片的全部深度成像, 以事后检查其状态。这对于新的实验者尤其有用, 他们可能不容易识别异常的微胶质细胞或单个 z 平面的碎片。然后, 在前30μm 中采取的 z 平面将在 z 投影步骤 (协议的步骤 5.1.2) 被排除。
一旦切片经过了感兴趣的复合处理并被记录, 则在每个时间点成像的一系列 z 平面 (不包括前 30μm) 将沿 z 轴投影, 从而制作 z 投影图像的2d 电影。需要注意的是, 在此处介绍的协议中, 用于最大 z 投影的厚度包括荧光可见的所有 z 切片 (通常为 180-220μm, 请参阅协议的步骤 5.1.2)。因此, z 切片的绝对数量的变化不会影响响应的量化。相反, 一些研究使用较薄的 z 堆栈 (40-60 微米) 进行 z投影6、7、11、27。这是另一种选择, 它带有排除一些 z 片表现出响应的风险, 因为我们观察到, 在一些实验中, 吸引效应在远离移液器尖端的地方可以看到70微米 (z)。因此, 如果首选更薄的选项, 则必须将 z 堆栈居中放在 z 中的移液器尖端上, 重要的是, 只能比较以相同的方式 (即使用所有荧光 z 片或使用薄 z 堆栈) 完成的 z 投影。
然后定义一个 r1 感兴趣的区域进行定量分析。图 4显示了 z 投影的 roi。红色虚线表示移液器的假定位置。黄色圆圈是 r1, 用 "冰" 绘制, 以移液器的假定尖端为中心。重要的是, 我们注意到, 在 r1 roi 的本地化的量化过程中出现了明显的变异性, 其错位导致对响应的低估。为了帮助在交付站点上定位 roi, 我们建议在将移液器放置在明亮场中时, 在采集软件中显示标尺, 以便将移液器尖端始终放置在要成像的现场中的同一中心 xy 位置。这就指示了在荧光图像的 z 投影中定位的位置, 然后, 在 z 投影中的 roi。但是, 最终的尖端位置, 因此, 实际的交货地点将从这个中心位置轻微转移, 这取决于移液器尖端所达到的深度。因此, 为了定位 r1, 我们考虑到另外三个标准: (i) r1 必须在移液器的顶端, 其位置是从右下角的黑暗背景推断出来的, (ii) 它应该对应于瞬态的区域当注射该化合物时, 组织变形发生, 并且 (ii) 它应该对应于观察到局部反应 (如果有的话) 的区域。如果这不足以很准确地定位交货点, 则将移液器填充荧光化合物将有所帮助。在绘制了 r1 后, 我们再次运行影片, 以检查它是否适合所有的时间点, 并且在任何时间点都没有异常漂移、失真或伪影荧光, 这可能会影响定量。与图 4相对应的影片, 并说明 atp 应用程序的效果, 可以在补充材料 (电影 s1) 中找到。
我们初步研究了微胶质过程对 p11 小鼠15岁丘脑 atp 或5-ht 的吸引力.最近, 这些实验被重复在切片从四天到两个月大的小鼠, 并在不同的地区 (例如, 图 3对应于海马区的记录)。我们主要使用三到四周大的小鼠, 它结合了成熟的大脑与成熟和成熟的微胶质和良好的切片活力的优势。重要的是, 具有代表性的正态微胶质细胞的特点是小的 soma, 长的过程与小终端, 并在基线条件下不断移动的过程。通常情况下, 在18至30天龄小鼠的切片中, 微胶质细胞的形态在切片制备后的6小时内基本保持不变。对于年龄较大的小鼠 (两个月大) 的切片, 保持切片生理状态的能力降低 (~ 4小时)。图 5提供了丘脑微胶质向运动的例子, 这些例子是对20天大的小鼠切片中的5-ht 的反应, 以及两个月大的小鼠切片中的 atp 的反应。与图 5中的5-ht 应用程序相对应的影片可以在补充材料 (电影 s2) 中找到。
图 6显示了在 scsf 中保存时间超过6小时的切片上进行的两个次优实验 (仅显示次数 0)。在图6a 中, 请注意微胶质细胞的存在与多个短的过程或扩大的终端, 让人想起神经元的生长锥, 并存在许多荧光细胞碎片或颗粒。这些荧光元件在成像过程中保持不动或随机移动, 表明它们不属于 "活" 的微胶质细胞 (参见补充材料中的影片 s3 )。需要注意的是, 在这个特殊的例子中, 微胶质细胞不断地扫描它们的环境, 但它们的形态发生了如此大的变化, 不能被认为处于生理状态。此外, 大量的碎片会使荧光分析不可靠。图 6b显示了具有大而扁平的细胞体或突起的微胶质细胞的存在, 有时可以在成像前几个小时保存的浅层切片上发现。只使用了表面的 z 位置来进行这种 z 投影。图 6c是一个子堆栈, 位于较深的 z 位置, 来自同一个大脑切片, 如图6C 所示。虽然它们没有定位在表面, 但这些微胶质细胞有一个不正常的 "浓密" 方面。由于微胶质细胞的作用, 与这两个切片相对应的电影没有用于量化。
从2d 电影中提取数据后, 可以通过随着时间的推移绘制归一化 r (t) 荧光来表示结果。图 7a中给出了一个总结多个实验的图, 以显示响应的可变性。请注意, 由于组织畸变 (即与移液器的液体注射会将组织推开, 然后增加), 注射后荧光会立即下降, 但会短暂下降 (在前三个图像中)。对 atp 反应的可变性说明了一个事实, 即即使切片看起来同样健康, 有运动和稀疏的微胶质细胞, 它们也不会以相同的方式响应 (但它们都是以相同的方式响应的)。除了内在样本的异质性之外, r1 定位也有一些松动, 如上文所述, 我们也不能排除例如, 所交付的解决方案体积差异的影响。因此, 要检测小的效果或变化, 使用复合注射的自动装置可能会很有趣。
图 7b显示了 roi 的大小如何也影响到 atp 诱导过程增长的量化。将直径从 35 (图 7a中使用的直径以及此处介绍的所有分析) 增加到50或 70μm, 通过抑制小 r1 定位的问题, 减少了实验 (切片) 之间的可变性。然而, 它也降低了检测到的反应的准确性和大小。事实上, 在较大的 roi 中, 由于不受治疗影响的过程或细胞体, 有更多的背景, 而过程的生长可能会因为伴随着远离移液器但更远的微胶质分支而被部分减弱在投资回报率之内。总之, 使用直径圆与35μm 不同的 roi 可能是相关的, 但在要比较的所有数据集中, roi 始终是相同的, 这一点至关重要。
图 7c显示了多项 acsf、atp 或5-ht 实验的平均± sem。atp 的效果与其他群体在体内使用类似方法获得的效果相同 (根据 dvalos 等人的说法, 根据 saynes 等人的说法, 为 0.5, 根据 haynes 等人的说法, 为 0.4), 切片中的 atp (如果像这里所做的那样归一化, 则为 0.8), 根据 dissing-olesen 等人的说法, 5 人和0.6 人的 说法是 pagani 等人的说法。一方面, 差异可能来自生物参数, 如切片制备方法、atp 注入量、鼠标年龄或使用的大脑区域, 另一方面也可能来自分析参数, 如 roi 的直径和投资回报率。用于 z 投影的 z 堆栈的厚度 (即检测到荧光的整个厚度, 或仅在移液器尖端周围的40-60 微米, 在那里需要最大的响应)。
在图7c 中, acsf 注射是负控制, 必要的检查局部注射和移液器的压力不会造成可能吸引微胶质过程的伤害。此外, acsf 控制允许研究人员检查随着时间的推移没有光漂白。事实上, 光漂白, 光子诱导的对荧光蛋白或荧光的破坏, 会导致荧光随着时间的推移逐渐减少。由于它可以偏置测量, 因此严格检查实验条件下是否没有光漂白是很重要的。为此, 建议在具有 gfp 表达微胶质细胞的切片上获取 xyzt 系列, 时间为 30分钟 (acsf 可以注射, 但实际上不需要刺激), 激发和采集参数设置为实验条件中的参数。然后, 在不同感兴趣的区域 (包括微胶质细胞体或过程) 对荧光的定量测量, 将揭示发射强度是否逐渐下降, 通常是指数衰减, 表明光漂白。如果是这种情况, 可以进行一些调整: 调整激光, 减少激光功率和增加探测器增益, 减少 z 平面的数量, 以及增加它们之间的间隔以限制照明。光漂白有利于大功率或长 (例如: 重复照明以实现线路平均) 激发;因此, 如果持续的照明被用来成像低荧光的细胞, 研究人员必须注意它。
局部注射 atp 或5-ht 后, r1 中荧光增加, 达到高原 (图 7c)。除了动力学, 它可以是有趣的比较吸引力在一个稳定的终点。在这里, 我们选择在t = 26分钟 (即注射后 20分钟) 表示微胶质反应, 如图7d所示。这对于统计比较化合物或测试可在浴缸中添加的拮抗剂的效果 (即在灌注溶液中, 或与移液器中的化合物一起添加 [未显示]) 是有用的。
图 1: 接口室详细信息.(a) 切片支架的3d 打印大纲。支架的外径为7厘米 (b) 与尼龙网 (箭头) 的界面片支架, 允许研究人员在液-气界面上保持切片。(c) 接口腔装置, 使切片在经过碳化的 (箭头指示用于起泡的管道) 和加湿环境中保持, 然后再进行成像。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 灌注室详细信息.(a) 3d 打印大纲。灌注室的外径为5.9 厘米 (b) 带尼龙网 (箭头) 的灌注室, 支持切片, 防止其接触下面的滑块, 并允许 acsf 在其上方和下方流动。(c) 双光子显微镜下的组件图片。将在当地输送化合物的微型移液器在右侧 (星号) 可见。(d) 在明亮场成像的移液器。刻度栏 = 60 微米. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 3: 微移液器在切片中的位置.用充满荧光素 (1μm) 的微型移液器获取一叠图像 (在30天大动物的海马体中) 的例子。荧光素可以在最大投影中沿 (a) z 轴或 (b) y 轴定位移液器 (星号)。请注意, 在面板b , 虽然在荧光较微弱, 也有微胶质细胞下方的移液器尖端。在这个图文并茂的示例中, 完整的堆栈, 包括在切片最表面部分拍摄的图像, 已用于投影。刻度杆 = 30 微米在面板a和指示 (每个毕业 = 50μm) 在面板 b。堆栈的 z 厚度 = 220μm. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 4: r1 的定位, 用于量化的 roi.此图显示了一个实验的三个实验时间点, 其中 atp 已被应用在切片上 (来自20天大动物的丘脑), 并绘制了移液器的假定位置 (第一个时间点的红线) 和 r1 的划分Roi。刻度杆 = 30μm. 注意右下角较深的区域, 对应于移液器的阴影, 这会干扰照明和成像。还请注意, 25分钟时强烈荧光的小区域, 这表明了移液器尖端的位置。堆栈的 z 厚度 = 220μm. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 5: 微胶质反应.应对20天大的小鼠的大脑切片上的 5-ht (5μm) 和两个月大的小鼠 (右; 切片 z 厚度 = 220 微米) 的局部应用和片上的 atp (500μm) 的局部应用。红色虚线表示移液器位置。这两个记录都是在丘脑做的, 上面的30微米的切片被排除在外。图像是在注射前 (上行) 和注射后 25分钟 (下排) 拍摄的。刻度栏 = 30μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 次优实验的示例.这些切片在成像前等待了 6个多小时, 并从上表面开始成像。(a) 具有大量碎片 (大致圆形, 荧光粒子, 但具有不规则边界; 星号) 和 "浓密" 的微胶质细胞 (箭头) 的 z 堆栈示例, 即具有许多但简短的过程。请注意, 扩大的工艺端子 (箭头) 看起来像轴突生长锥。堆栈的 z 厚度 = 220 微米。其他两个面板显示同一切片的两个子堆栈, 包括 (b) 1-30 z 平面 (z 厚度 = 59μm) 和 (c) 30-120 z 面 (z 厚度 = 180 微米)。在顶部平面上 (如面板b 所示), 除了像a 面板中的大型工艺端子和碎片外, 还有具有异常大的扁平体或突起 (恒星) 的微胶质细胞。在较深的平面上 (如c 面板所示), 没有碎屑, 也没有扁平物体, 但细胞是浓密的 (箭头), 密度异常高。总之, 这些观察表明, 微胶质细胞并不处于正常状态。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 微胶质过程吸引力的定量.(a) atp 系列实验的例子, 以说明可变性。(b) 投资回报率大小对量化的影响。a 面板 (atp 注射) 中显示的每个实验都经过了投资回报率为35、50或70μm 的分析。对于不同的 roi, 每个时间点的荧光平均± sem 都显示出来。(c) acsf、5-ht 和 atp 实验摘要。acsf 注射对微胶质过程的位置没有影响。atp 和5-ht 诱导向移液器的微胶质过程局部生长, 测量随荧光局部增加。表示了平均±扫描电镜。(d) t = 注射后20分钟的微胶质反应摘要 (从记录开始 26分钟)。表示了平均±扫描电镜。采用邓内特后临时测试的单向方差分析。* * p < 0.01, * * * p < 0.001 相比, acsf 注射。对于 acsf, n = 7;对于 atp, n = 8;为 5-ht, n = 6。所有这些实验都是在丘脑进行的, 但从海马体或皮层也能得到类似的结果。用于 z 投影和定量的堆栈的 z 厚度 = 180-220 微米。除 b 组以外的所有措施都是以35μm 直径的 roi 完成的。请点击这里查看此图的较大版本.
电影 s1: 本地 atp (500μm) 应用的效果示例.这个实验已经在一个20天的动物的丘脑进行。此影片中的图像已用于图 4。刻度栏 = 30μm. 请点击这里查看此视频。(右键单击下载.
电影 s2: 局部 5-ht (5μm) 应用的效果示例.这个实验已经在一个20天的动物的丘脑进行。此影片中的图像已用于图 5 (左)。刻度栏 = 30μm. 请点击这里查看此视频。(右键单击下载.
影片 s3: 在等待超过6小时后才进行成像的切片中的次优实验示例.注意随着时间的推移随机移动的大量碎片的存在和微胶质细胞的异常形态。此影片中的图像如图 6a所示。刻度栏 = 30μm. 请点击这里查看此视频。(右键单击下载.
补充文件: 成像室和接口保持室.请点击此处下载此文件.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
急性脑片通过保持一种结构完整性和有限的网络调整, 与离解或有机切片培养不同, 使研究人员能够在其生理环境中研究微胶质细胞。然而, 其中一个主要的限制是, 切片程序造成的伤害, 可以迅速损害神经元的生存能力, 特别是在成人大脑。由于微胶质细胞对细胞损伤的反应特别严重, 因此尽可能地限制神经元细胞死亡以保持微胶质细胞接近其生理状态是很重要的。这反过来又通过良性循环有助于更好地改善切片的一般状况。
本文中描述的协议应用了在化学生理学实验文献中发现的一些改进, 目的是在几个小时内获得更好的薄片生存能力, 特别是成年小鼠的生存能力。为了克服与年龄有关的切片活力差距, 我们用胆碱代替钠, 并在心脏灌注、切片和恢复阶段使用这种胆碱-脑卒中培养基。这使得细胞兴奋毒性至少达到 29,30。需要注意的是, 除了胆碱-抗脑脊液外, 还有许多其他替代的 csf 食谱对神经元保存非常有效, 如 n-甲基 d-氨基葡萄糖 (ngdg)-acsf 31, 这对微胶质研究也可能很有趣但还没有在这里接受过测试这个过程中的另一个关键步骤是心脏灌注。通过将含有低 na +、低钙2+ 和高镁 2 + 的冷胆碱-acsf溶液注入动物, 可以诱导体温迅速下降, 降低大脑中细胞的代谢活性, 从而降低切割引起的细胞应激。事实上, 我们观察到, 这种方法提供了更多的保护, 而不仅仅是删除整个大脑, 并将其淹没在 acsf 解决方案中。在为膜片钳和光遗传学研究优化的协议的启发下, 我们还在物理切片后立即使用了 "保护性恢复" 期, 使切片在32岁的胆碱-反 icf 切片创伤中恢复了10分钟°c。随后, 切片被转移到接口保持室, 以恢复额外的最小时间30分钟。第二个恢复期的持续时间可以根据大脑感兴趣的区域、na+替代品和动物的年龄进行优化, 如果电生理必须与成像平行进行, 则应持续至少1小时。
在使用前保持切片的健康状态和成像过程中的灌注也是重要的参数。界面和双灌注室都是电生理学领域广泛确立的工具。例如, 自 1995年以来, 界面方法一直被用来提高海马切片的生存能力。与这里使用的室类似的设备是由几家公司提出的, 但还不是通常用于微胶质成像。我们设计了一个界面保持室, 其中切片躺在一个网上, 并与一个大型的 csf 水库的接口, 延缓细胞恶化的切片在延长孵化时间。在成像室中, 我们使用了设计的双面灌注室, 可增加急性切片制剂的氧合, 在多光子显微镜下保持细胞的健康状态。与单灌注相比, 水下切片的双重灌注增加了细胞的生存能力, 因为氧气以及其他材料可以自由和有效地从相当厚的切片两侧的高流速扩散。
该协议旨在量化 atp 或其他化合物对微胶质过程的全局吸引效应, 其量化方法是以 dvalos 等人3中使用的方法为基础的.可以执行其他类型的分析。例如, 另一种方法是测量复合后移液尖端周围的空位减少, 这种方法不取决于微胶质过程的荧光水平, 但需要实验者采取更多的行动进行图像分析应用11,32。也可以跟踪单个微胶质过程15、28的尖端的运动。
此外, 微胶质细胞的各向同性动力或监测也可以登记在基础条件下, 或在浴应用的利益化合物的切片与本协议制备的切片。然而, 为了量化微胶质过程的快速扩展和收缩率并检测潜在的变化, 增加采集频率是相关的。例如, pagani 等人使用每10秒28一张图像的频率.
最后, 最近的出版物描述了在三个维度上量化形态变化或个别过程运动的方法。对于这种分析, 虽然 z 步长为2μm 对于某些程序27来说就足够了, 但其他程序则需要更好的轴向分辨率 (即根据 heindl 等人的说法, z 步长为 0.4微米。
在这里, 我们展示了在野生类型小鼠身上进行的实验, 这些小鼠在微胶质细胞中具有 gfp 的内源性表达, 并在机械上应用化合物, 但这一协议可以适应微胶质细胞中的其他荧光记者蛋白, 如 yfp18, 或用于外源性微胶质细胞标记与荧光分离素11,34。最后, 我们研究了微胶质过程在野生类型正常环境中局部应用 atp 或5-ht 的结果, 但该协议可用于测试其他化合物、其他类型的刺激 (如笼状化合物), 并测试如何定向运动受突变、药理作用剂或病理背景的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢穆林研究所的细胞和组织成像设施, 在那里进行了所有的图像采集和分析。这项工作得到了国家科学研究中心、国家研究和研究研究所、索邦大学科学研究所以及索邦大学-皮埃尔·玛丽·居里大学赠款的部分支持 (emargemce-upmc 方案, Recherche sur le cerveau 基金会, 法国基金会, "equipe frm deq2010" 基金会, 法国研究部 (国家研究机构, Recherche)anr-17-ce16-008 和 "bio-psy labex" anr-11-idex-000-02) 和计算神经科学方案合作研究, 国家科学基金会/法国国家研究机构 (编号: 1515686)。所有作者都附属于巴黎神经科学学院 (enp) 和 bio-psy labex 的研究小组。f. e. 是法国巴黎 f-75005 索邦大学附属博士生, 由 bio-psy labex 资助。v. m. 是由法国国家科学基金会/法国国家研究机构计算神经科学合作研究项目资助的博士后研究员 (编号: 1515686)。提交人感谢参与启动该项目的 marta kolodziejczak。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32 °C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8 mL with fin tip, but we cut it (approx 7 cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32 °C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4 °C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20 °C. 500 µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5 mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
- Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
- Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
- Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
- Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
- Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
- Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
- Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).
- Mainen, Z. F., et al.
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
- Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).
