Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genética

Геном редактирование в Mammalian клеток линии, используя ТРИФОСФАТЫ-Cas

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

ТРИФОСФАТЫ-Cas — это мощная технология инженер комплекс геномов растений и животных. Здесь мы подробно протокол эффективно редактировать генома человека с использованием различных эндонуклеазами Cas. Мы отмечаем важные соображения и расчетные параметры для оптимизации эффективности редактирования.

Abstract

Кластерный системы регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) функции естественно в бактериальных адаптивного иммунитета, но успешно многократно использовать для генома инженерии в многих различных живых организмов. Чаще всего Cas12a эндонуклеазы используется прилепится определенных сайтов в геноме, после чего перерыв двуцепочечной ДНК будет восстановлена через не гомологичных конце присоединения (NHEJ) путь или ориентированные на гомологии ремонт (или wildtype ТРИФОСФАТЫ связанные 9 (Cas9) HDR) путь в зависимости от того, является ли шаблон доноров отсутствует или представить соответственно. На сегодняшний день, ТРИФОСФАТЫ систем от различных видов бактерий было показано, чтобы быть способными выполнять изменения генома в mammalian клетках. Однако несмотря на кажущуюся простоту технологии, несколько конструктивных параметров должны рассматриваться, которые часто оставляют пользователи недоумевали о том, как лучше всего выполнять их геном редактирования экспериментов. Здесь мы описываем полный рабочий процесс из экспериментального дизайна для идентификации ячейки клонов, которые несут желаемые изменения ДНК, с целью облегчения успешного выполнения редактирования эксперименты в mammalian клетки линии генома. Мы подчеркиваем основные соображения для пользователей, чтобы принять к сведению, включая выбор системы ТРИФОСФАТЫ, длина распорку и дизайн шаблона доноров одноцепочечной oligodeoxynucleotide (ssODN). Мы предполагаем, что этот процесс будет полезен для гена нокаут исследований, моделирования усилия, болезни или поколения репортер мобильных линий.

Introduction

Способность инженер геном любого живого организма имеет много биомедицинских и биотехнологических приложений, например коррекции болезнетворные мутации, строительство точных моделей для исследования заболеваний, или поколения сельскохозяйственных культур с желательные черты. С начала века, различные технологии были разработаны для техники генома клеток млекопитающих, включая meganucleases¹^,²^,³, цинковый палец nucleases⁴^,⁵, или Транскрипция эффекторных активатор как nucleases (Таленс)⁶^,^,⁷⁸^,⁹. Однако эти более ранних технологий трудно программы или утомительно собрать, препятствуя тем самым их широкое распространение в научных исследований и промышленности.

В последние годы кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) – связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) системы стала мощной новой генома, инженерные технологии¹⁰^,¹¹. Первоначально адаптивной иммунной системы в бактерии, он был успешно развернут для модификации генома растений и животных, включая человека. Основная причина, почему ТРИФОСФАТЫ-Cas популярность так много за такое короткое время, что элемент, который приносит ключевых эндонуклеазы Cas, например Cas9 или Cas12a (также известный как Cpf1), в нужное место в геноме это просто небольшой фрагмент химерных единого руководства RN A (sgRNA), которая является простой дизайн и дешевые синтезировать. После набираются на целевой сайт, Cas фермента функционирует как молекулярные ножницы и расщепляет ДНК связанного с его RuvC, HNH или КНУ доменов¹²^,^,¹³¹⁴. Результате двойной мель перерыв (DSB) впоследствии отремонтированы клетки через ориентированные на гомологии ремонт (HDR) путь или не гомологичных конце присоединения (NHEJ). В отсутствие шаблона ремонт DSB отремонтированы по ошибкам NHEJ пути, который может привести к псевдо-случайных вставки или удаления нуклеотидов (indels) в месте разреза, потенциально вызывая фреймшифт мутации в генах, белок кодирования. Однако в присутствии доноров шаблон, содержащий требуемые изменения ДНК, DSB восстановлена дорожка HDR высокой верности. Общие типы доноров шаблоны включают одноцепочечной олигонуклеотиды (ssODNs) и плазмид. Бывший обычно используется, если предполагаемого изменения ДНК небольшие (например, изменение одной пары базы), в то время как последние обычно используется, если один хочет, чтобы вставить относительно длинная последовательность (например, кодирующая последовательность зеленого флуоресцентного белка или GFP) в целевой Локус.

Эндонуклеазы активность белка Cas требует наличия protospacer прилегающие мотив (PAM) на целевой сайт¹⁵. Пэм Cas9 находится в конце 3′ protospacer, в то время как Пэм Cas12a (также называемый Cpf1) находится в конце 5′ вместо¹⁶. Cas руководство РНК комплекс не в состоянии представить DSB, если PAM отсутствует¹⁷. Следовательно PAM места ограничения в геномной местах, где особенно нуклеиназы Cas способен расщеплять. К счастью Cas nucleases из различных видов бактерий обычно демонстрируют различные требования PAM. Таким образом путем интеграции различных систем ТРИФОСФАТЫ-Cas в наших инженерных инструментов, мы можем расширить круг сайтов, которые могут быть направлены в геноме. Кроме того естественный фермент Cas может быть спроектирован или эволюционировали признать альтернативных последовательностей PAM, дальнейшего расширения масштабов геномной целей доступным для манипуляции¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Хотя несколько ТРИФОСФАТЫ-Cas системы доступны для технических целей генома, большинство пользователей технологии полагались главным образом на Cas9 Нуклеаза от Streptococcus pyogenes (SpCas9) по нескольким причинам. Во-первых он требует относительно просто NGG Пэм, в отличие от многих других белков Cas, которые может только расщеплять при наличии более сложных пам. Во-вторых это первый Cas эндонуклеазы успешно развернуты в клетки человека²¹^,^,²²²³^,²⁴. В-третьих SpCas9 является на сегодняшний день лучше всего характеризуется фермент на сегодняшний день. Если исследователь хочет использовать другой нуклеиназы Cas, он или она часто будет ясно о том, как лучше разработать эксперимент, и насколько хорошо другие ферменты будет выполнять в различных биологических условиях по сравнению с SpCas9.

Чтобы внести ясность в относительной эффективности различных систем ТРИФОСФАТЫ-Cas, мы провели недавно систематическое сравнение пяти Cas эндонуклеазами – SpCas9, Cas9 фермента от золотистого стафилококка (SaCas9), энзим Cas9 от Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a фермента от Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCas12a) и Cas12a фермента от бактерия Lachnospiraceae ND2006 (LbCas12a)²⁵. За справедливое сравнение мы оценивали различные Cas nucleases, используя тот же набор целевых объектов и других экспериментальных условий. Исследование также определила дизайн параметры для каждой системы ТРИФОСФАТЫ-Cas, которая будет служить полезным справочным материалом для пользователей технологии. Здесь, чтобы лучше включить исследователей использовать ТРИФОСФАТЫ-Cas системы, мы предоставляем пошаговые протокол для оптимального генома техники с различными Cas9 и Cas12a ферменты (см. Рисунок 1). Протокол включает не только экспериментальных детали, но также важных конструктивных соображений необходимо максимизировать вероятность успешного генома инженерных решений в mammalian клетках.

Рисунок 1 : Обзор рабочего процесса для создания генома линий клеток человека отредактированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

1. дизайн sgRNAs Выберите соответствующую систему ТРИФОСФАТЫ-Cas. Во-первых проверьте целевого региона для PAM последовательности всех Cas9 и Cas12a nucleases, которые показали, чтобы быть функциональным в mammalian клетках16,21-32. Пять часто используемые ферменты приведены в таблице 1</stro…

Representative Results

Для выполнения генома редактирования эксперимент, ТРИФОСФАТЫ плазмида, выражая sgRNA ориентации, локус интерес должен быть клонированы. Во-первых плазмида переваривается с энзима ограничения (обычно типа IIs фермент) для линеаризации его. Рекомендуется для устранения переваривается прод…

Discussion

Система ТРИФОСФАТЫ-Cas является мощным, революционная технология для инженер геномов и transcriptomes растений и животных. Содержат ТРИФОСФАТЫ-Cas систем, которые потенциально могут быть адаптированы для генома и транскриптом инженерных целей⁴⁴были найдены многочисленные виды бак…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. поддерживается агентства грант для Объединенного бюро Совета науки, технологий и научных исследований (1431AFG103), Национальный совет медицинских исследований Грант (OFIRG/0017/2016), Национальный исследовательский фонд предоставляет (NRF2013-THE001-046 и NRF2013-THE001-093), Министерство образования Tier 1 Грант (RG50/17 (S)), запуска грант от Nanyang технологический университет и фондов для генетически Инженерная машина (МПСЭ) международного конкурса от Nanyang технологический университет.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

Referências

Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genética. 188 (4), 773-782 (2011).
Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).