Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Kaiwen  Ivy Liu; Norfala-Aliah  Binte Sutrisnoh; Yuanming Wang; Meng How Tan

doi:10.3791/59086

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genética

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Published: April 11, 2019

doi:

10.3791/59086

Kaiwen Ivy Liu, Norfala-Aliah Binte Sutrisnoh, Yuanming Wang², Meng How Tan²

¹Genome Institute of Singapore,Agency for Science Technology and Research, ²School of Chemical and Biomedical Engineering,Nanyang Technological University

Summary

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Abstract

Kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) sistem doğal olarak bakteriyel edinilmiş bağışıklık fonksiyonları ama başarılı bir şekilde pek çok farklı canlıların genom mühendisliği için repurposed. En sık wildtype CRISPR 9 (Cas9) ilişkili veya Cas12a endonükleaz sonra homolog olmayan sonunda (NHEJ) yol veya onarım homoloji-yönetmen (katılma yolu ile DNA çift iplikçikli sonu onarılana genom, belirli sitelerde ayırmak için kullanılır Bir donör şablon olmasına bağlı olarak HDR) yolu yok veya sırasıyla mevcut. Bugüne kadar farklı bakteri türleri sistemlerden CRISPR genom memeli hücrelerinde düzenleme gerçekleştirme yeteneğine sahip olması gösterilmiştir. Ancak, teknoloji belirgin basitliğine rağmen birden çok tasarım parametrelerinin değerlendirilmesi, hakkında en iyi deneyler düzenleme onların genom taşımak için çapraşık kullanıcılar sık sık terk gerekir. Burada, tam bir iş akışı deneysel tasarım başarılı memeli hücre hatları deneylerde düzenleme genom yürütülmesini kolaylaştırmak amacı ile istenilen DNA değişiklikleri taşıyan Hücre klonlar tanımlaması için açıklamak. Biz kullanıcıların, dikkat çekmek kritik noktalar CRISPR sistem, rondela uzunluğu ve tek iplikçikli oligodeoxynucleotide (ssODN) donör şablonunun tasarımını seçimi de dahil olmak üzere vurgulayın. Biz bu iş akışı için gen nakavt çalışmaları, çabaları, modelleme hastalığı faydalı olacaktır veya satırları üretimi muhabiri hücre öngörülüyor.

Introduction

Hastalığa neden olan düzeltilmesi gibi birçok Biyomedikal ve Biyoteknolojik uygulamaları herhangi bir canlı organizma genom mühendis yeteneğine sahiptir mutasyonlar, hastalık çalışmalar için doğru hücresel modelleri inşaatı veya, tarımsal üretimi arzu edilen özellikleri ile bitkileri. Yüzyılın beri genom Mühendisliği dahil meganucleases¹^,²^,³memeli hücrelerinde için çeşitli teknolojiler geliştirilmiştir, parmak nükleaz⁴^,⁵, çinko veya Transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör enzimler (TALENs)⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Ancak, bu önceki böylece onların yaygınlaşmasının araştırma ve endüstrisi engelleyici programı için zor ya da sıkıcı bir araya getirmek teknolojilerdir.

Son yıllarda, kümelenmiş düzenli olarak kısa palindromik yineler (CRISPR) interspaced – CRISPR-ilişkili (Cas) sistem teknoloji¹⁰^,¹¹mühendislik güçlü yeni genom ortaya çıkmıştır. Aslında bir adaptif bağışıklık sisteminde bakteri, başarıyla oldu genom değişiklik bitkiler ve hayvanlar, insanlar da dahil olmak üzere dağıtılmış. Neden CRISPR-Cas kısa bir sürede çok popülerlik kazanmıştır bir temel nedeni bu Cas9 veya Cas12a (Ayrıca Cpf1 da bilinir) gibi anahtar Cas endonükleaz getiriyor öğe, genom doğru konuma chimeric tek Kılavuzu RN sadece kısa bir parçası (SgRNA), bir tasarım için basit ve ucuz sentezlemek. Hedef siteye işe ediliyor sonra CA’ları enzim moleküler makas çifti olarak işlev görür ve onun RuvC, HNH veya Nuc etki alanları¹²^,¹³^,¹⁴ile ilişkili DNA cleaves. Elde edilen çift telli sonu (DSB) daha sonra homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma veya homoloji yönetmen onarım (HDR) yolu ile hücreleri tarafından onarıldı. Onarım şablon yokluğunda, DSB potansiyel olarak protein kodlayıcı genlerin frameshift mutasyonlar neden çıkmasına neden takma ad-rasgele ekleme veya silmek-in nükleotit (indels) kesim yerinde olabilir, hataya NHEJ yolu tarafından onarıldı. Ancak, istediğiniz DNA değişiklikleri içeren bir donör şablonu huzurunda DSB yüksek sadakat HDR yolu tarafından onarıldı. Donör şablonları sık karşılaşılan tek iplikçikli oligonucleotides (ssODNs) ve plazmid bulunmaktadır. Eğer bir nispeten uzun bir sıra eklemek dilek ikinci genellikle kullanılırken dilediğiniz DNA değişiklikleri (örneğin, tek bir baz çifti İLETİMLERİNİZE), küçük eski genellikle kullanılır (örneğin, bir yeşil flüoresan protein kodlama dizisi veya GFP) hedef locus içine.

CA’ları protein endonükleaz Etkinlik hedef site¹⁵bir protospacer bitişik motifi (PAM) olmasını gerektirir. (Cpf1 olarak da bilinir) Cas12a PAM 5′ sonunda bunun yerine olmakla Cas9 PAM¹⁶3′ sonunda protospacer olduğunu. Cas-Kılavuzu RNA karmaşık PAM¹⁷ise bir DSB tanıtmak değiştiremiyor. Bu nedenle, PAM belirli bir Cas nükleaz ayırmak mümkün nerede genomik Mekanlar üzerinde bir kısıtlama yerleştirir. Neyse ki, Cas enzimler farklı bakteri türleri üzerinden genellikle farklı PAM gereksinimleri sergi. Bu nedenle, çeşitli CRISPR-Cas sistemleri mühendislik bizim alet entegre ederek, bir genom hedefleyebilir siteleri aralığını genişletebilirsiniz. Ayrıca, doğal bir Cas enzim mühendislik veya daha fazla genomik hedefleri manipülasyon¹⁸^,¹⁹^,²⁰‘ ye erişilebilir kapsamını genişletme alternatif PAM dizileri tanımasını gelişti.

Teknolojisi çoğu kullanıcı için birden çok nedeni birden çok CRISPR-Cas sistemi genom mühendislik amaçları için kullanılabilir olmakla birlikte, ağırlıklı olarak Cas9 nükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden yararlanmıştır. Birincisi, bir nispeten sade bir şekilde NGG PAM, aksine sadece varlığında daha karmaşık PAMs bölmek birçok diğer Cas protein gerektirir. İkincisi, bu insan hücreleri²¹^,²²^,²³^,²⁴‘ te başarılı bir şekilde dağıtılması için ilk Cas endonükleaz ‘s. Üçüncü olarak, SpCas9 bugüne kadar en iyi karakterize enzim gereğidir. Bir araştırmacı başka bir Cas nükleaz kullanmak isterse, o ya da o sık sık tasarım deneme ve nasıl su kuyusu diğer enzimler için SpCas9 göre farklı biyolojik bağlamlarda yapmak için en iyi nasıl hakkında belirsiz olur.

Farklı CRISPR-Cas sistemleri göreli performansını konusunu açıklığa kavuşturmak amacıyla, biz son zamanlarda beş Cas endonucleases – SpCas9, Staphylococcus aureus (SaCas9), Cas9 enzim dan gelen Cas9 enzim sistematik karşılaştırılması gerçekleştirdiyseniz Neisseria meningitidis (NmCas9), Cas12a enzim Acidaminococcus sp. BV3L6 üzerinden (AsCas12a) ve Cas12a enzim (LbCas12a) Lachnospiraceae bakteri ND2006 üzerinden²⁵. Adil bir karşılaştırma için hedef siteleri ve diğer deneysel koşullar aynı kümesini kullanarak çeşitli Cas nükleaz değerlendirildi. Teknoloji kullanıcıları için yararlı bir başvuru olarak hizmet verecek her CRISPR-Cas sistem ayrıca belirlenen çalışma tasarım parametreleri. Burada, daha iyi araştırmacılar CRISPR-CA’larına faydalanmak için etkinleştirme sistemi, biz en iyi genom Mühendisliği (bkz. şekil 1) farklı Cas9 ve Cas12a enzimleri ile için adım adım bir protokol sağlar. Protokol sadece başarılı genom mühendislik sonucu memeli hücrelerinde olasılığını en üst düzeye çıkarmak için de önemli tasarım konuları ama deneysel ayrıntıları içerir.

Resim 1 : İnsan hücre hatları düzenlenmiş genom oluşturmak için iş akışının genel bir bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protocol

1. tasarım sgRNAs Uygun bir CRISPR-Cas sistemi seçin. İlk olarak, hedef bölge içinde memeli hücreleri16,21-32işlevsel olması için gösterilen tüm Cas9 ve Cas12a enzimler PAM dizisi için kontrol edin. Beş sık kullanılan enzimler Tablo 1 onların anılan sıraya göre PAMs birlikte verilmiştir.Not: yanında endonucleases Tablo 1′ de listelenen, Streptococcus thermophilus (St1Cas9) üzerinden Cas9 nükleaz gibi memeli hücrelerinde de…

Representative Results

Deney, ilgi odağı klonlanmış gerekiyor hedefleme bir sgRNA ifade CRISPR plazmid düzenleme genom gerçekleştirmek için. İlk olarak, plazmid bir kısıtlama bu linearize için enzim ile (genellikle bir türü IIS enzim) sindirilir. Bu % 1’özel jel ile birlikte komple ve Parsiyel sindirim arasında ayırt etmek için sindirilmemiş bir plazmid sindirilir ürünü gidermek için tavsiye edilir. Sindirilmemiş plazmid supercoiled olduğu gibi onlar doğrusallaştırılmış karşılıkları (bkz: <strong class="xfig"…

Discussion

CRISPR-Cas sistemi genleri ve transcriptomes bitki ve hayvan Mühendisi için güçlü, devrimci bir teknolojidir. Çok sayıda bakteri türlerinin potansiyel olarak genom ve transcriptome amacıyla⁴⁴mühendislik için adapte olabilir CRISPR-Cas sistemleri içeren tespit edilmiştir. Cas9 endonükleaz Streptococcus pyogenes (SpCas9) üzerinden diğer bakteriyel gelen enzimler insan hücreleri²¹^,²²^,^23</…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.H.T. bir ajans için bilim teknoloji ve araştırma’nın ortak Konseyi Office grant (1431AFG103) tarafından desteklenmektedir, Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi grant (OFIRG/0017/2016), Ulusal Araştırma Vakfı Hibe (NRF2013-THE001-046 ve NRF2013-THE001-093), bir Bakanlığı Eğitim Tier 1 verme (RG50/17 (S)), bir başlangıç Nanyang Teknoloji Üniversitesi ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi Uluslararası genetik mühendislik makine (IGEM) rekabet için para verin.

Materials

T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)	NEB	M0371
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Buffer, 50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 40 mM Tris, 20 mM acetic acid, and 1 mM EDTA.
Tris-EDTA (TE) Buffer, 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Dilute to 1X before use. The 1X solution contains 10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA Ligase	NEB	M0202	400,000 units/ml
Quick Ligation Kit	NEB	M2200	An alternative to T4 DNA Ligase.
Rapid DNA Ligation Kit	Thermo Scientific	K1423	An alternative to T4 DNA Ligase.
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit	Thermo Scientific	451245	The salt solution comes with the TOPO vector in the kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit for Gibson assembly.
One Shot Stbl3 Chemically Competent E.Coli	Thermo Scientific	C737303
LB Broth (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L3022	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
LB Broth with Agar (Lennox), powder	Sigma Aldrich	L2897	Reconstitute in ddH₂0, and autoclave before use
SOC media	–	–	2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM glucose in 1 L of LB Broth
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1st Base	BIO-5185
Agarose	1st Base	BIO-1000
T7 Endonuclease I	NEB	M0302
Plasmid DNA Extraction Miniprep Kit	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose	Hyclone	SH30081.01	4.5 g/L Glucose, no L-glutamine, HEPES and Sodium Pyruvate
L-Glutamine, 200mM	Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10, 000U/mL	Gibco	15140
0.25% Trypsin-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160	FBS is heat inactivated before use at 56 ^oC for 30 min
Phosphate Buffered Saline, 1X	Gibco	20012
jetPRIME transfection reagent	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA Extraction Solution, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Genomic DNA Kit	Bioline	BIO-52067	An alternative to QuickExtract
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0491
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA
Protease Inhibitor Cocktail, Set3	Merck	539134
Nitrocellulose membrane, 0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-glycine-SDS buffer, 10X	Bio-Rad	1610772	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS.
Tris-glycine buffer, 10X	1st base	BUF-2020	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris and 192 mM glycine.
Ponceau S solution	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1st base	BUF-3030	Dilute to 1X before use. The 1x solution contains 25 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 150 mM NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Skim Milk for immunoassay	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
Antibody for β-actin (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Lot number: C0916
MiSeq system	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit fluorometer	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR plasmid: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: xCas9 3.7	Addgene	108379	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: hCas9	Addgene	41815	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.
CRISPR plasmid: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Single vector system: The gRNA is expressed from the same plasmid.
CRISPR plasmid: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Dual vector system: The gRNA is expressed from a different plasmid.

Referências

Epinat, J. C., et al. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Research. 31 (11), 2952-2962 (2003).
Arnould, S., et al. Engineered I-CreI derivatives cleaving sequences from the human XPC gene can induce highly efficient gene correction in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 371 (1), 49-65 (2007).
Chapdelaine, P., Pichavant, C., Rousseau, J., Paques, F., Tremblay, J. P. Meganucleases can restore the reading frame of a mutated dystrophin. Gene Therapy. 17 (7), 846-858 (2010).
Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genética. 188 (4), 773-782 (2011).
Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology. 29 (2), 143-148 (2011).
Zhang, F., et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnology. 29 (2), 149-153 (2011).
Boch, J., et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
Nishimasu, H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 156 (5), 935-949 (2014).
Yamano, T., et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell. 165 (4), 949-962 (2016).
Swarts, D. C., Mosterd, C., van Passel, M. W., Brouns, S. J. CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition. PLoS One. 7 (4), e35888 (2012).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
Kleinstiver, B. P., et al. Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition. Nature Biotechnology. 33 (12), 1293-1298 (2015).
Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, e00471 (2013).
Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
Wang, Y., et al. Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells. Genome Biology. 19 (1), 62 (2018).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (39), 15644-15649 (2013).
Kim, E., et al. In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni. Nature Communications. 8, 14500 (2017).
Edraki, A., et al. A Compact, High-Accuracy Cas9 with a Dinucleotide PAM for In Vivo Genome Editing. Molecular Cell. , (2018).
Chatterjee, P., Jakimo, N., Jacobson, J. M. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances. 4 (10), (2018).
Muller, M., et al. Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas9 Systems Enable Specific Editing of the Human Genome. Mol Therapy. 24 (3), 636-644 (2016).
Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nature Methods. 10 (11), 1116-1121 (2013).
Boratyn, G. M., et al. BLAST: a more efficient report with usability improvements. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W29-W33 (2013).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42 (Web Server issue), W401-W407 (2014).
Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
Richardson, C. D., Ray, G. J., Bray, N. L., Corn, J. E. Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes. Nature Communications. 7, 12463 (2016).
Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
Zhang, J. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biology. 18 (1), 35 (2017).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPR-Cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nature Communications. 8 (1), 2024 (2017).
Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, e04766 (2014).
Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Research. 41 (19), 9049-9061 (2013).
Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citar este artigo

Liu, K. I., Sutrisnoh, N. B., Wang, Y., Tan, M. H. Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas. J. Vis. Exp. (146), e59086, doi:10.3791/59086 (2019).