Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero
Summary
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per isolare piccole vescicole extracellulari (SVE) dai tessuti interi, compresi i campioni di cervello e del tumore. Questo metodo offre una tecnica riproducibile per estrarre SVE da tessuto solido per ulteriori analisi a valle.
Abstract
Circolante e interstiziale piccole membrana-limita (SVE) vescicole di extracellulare rappresentano un bersaglio promettente per lo sviluppo di saggi di nuovo biomarcatore diagnostico o prognostico e probabilmente servono come giocatori importanti nella progressione di un vasto spettro di malattie. Ricerca corrente è focalizzata sulla caratterizzazione delle vescicole secernuta da cellule multiple e tipi di tessuto al fine di meglio comprendere il ruolo di EVs nella patogenesi di condizioni tra cui neurodegenerazione, infiammazione e cancro. Tuttavia, globalmente coerenti e riproducibili tecniche per isolare e purificare le vescicole rimangono in corso. Inoltre, a malapena vengono descritti metodi per l’estrazione del SVE da tessuto solido ex vivo . Qui, forniamo un protocollo dettagliato per estrarre piccoli EVs di interesse dai tessuti intero freschi o congelati, compreso i campioni del cervello e del tumore, per ulteriore caratterizzazione. Dimostriamo l’adattabilità di questo metodo per analisi multiple a valle, tra cui la microscopia elettronica e immunophenotypic caratterizzazione delle vescicole, così come la spettrometria di massa quantitativa delle proteine di EV.
Introduction
Piccole vescicole extracellulari (SVE) includono endosomal-derivato esosomi e microvescicole membrana-capannone piccolo di ampio interesse biomedico. Piccoli SVE sono composti da una popolazione eterogenea di vescicole di membrana-limitano nm 50-250 contenenti proteine biologicamente attive, i lipidi e gli acidi nucleici che collettivamente sono creduti per svolgere ruoli importanti in una moltitudine di processi di malattia. Progresso della ricerca è particolarmente implicata queste vescicole in neurodegenerative e malattie da prioni, processi infettivi, condizioni infiammatorie o autoimmuni e la crescita del tumore e metastasi1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ricerca biomedica in rapida crescita del significato di EVs nella patogenesi della malattia ha generato interesse parallela allo sviluppo di metodi riproducibili e rigorosi per l’isolamento e la purificazione di queste vescicole.
Una sfida storica e attuale nella caratterizzazione di EV è stata l’incapacità di separare completamente piccola EV sottopopolazioni. Questa sfida è in gran parte a causa della nostra comprensione limitata dei differenti meccanismi molecolari che regolano la biogenesi delle vescicole distinte. Sovrapposizione di dimensioni, densità e carico biologico tra sottopopolazioni ulteriormente spire queste distinzioni. Parte di questa sfida è stato anche l’uso di diverse tecniche di arricchimento, fornendo un’incoerenza in analisi a valle delle vescicole isolate attraverso laboratori e minare lo sforzo globale per illuminare categorico EV popolazioni ampiamente.
Vale la pena notare che la maggior parte della caratterizzazione EV è stata eseguita da collezione in vitro della coltura delle cellule surnatante, con studi in vivo più recenti che descrivono le tecniche per isolare le vescicole da fluidi corpo umani o animale, tra cui plasma, urina e la saliva. Mentre SVE sono presenti in grandi quantità in circolazione, ha anche riconosciuto che queste vescicole svolgono un ruolo importante negli eventi di comunicazione cellula-cellula e sono presenti nell’interstizio dei tessuti cellulari. Nel contesto di cancro, EVs interstiziale può essere particolarmente importante nella modulazione del microambiente tumorale per la semina delle cellule di cancro e crescita metastatica14,15. Di conseguenza, non c’è valore nello sviluppo e nell’ottimizzazione delle tecniche per estrarre le vescicole da campioni di tessuto solido. Questi metodi fornirà un mezzo per studiare direttamente organo – o tumore – derivato EVs raccolti da campioni clinici, tra cui piccole biopsie e resezioni organo parziale o completo.
In questo studio e in un precedente rapporto pubblicato dal nostro laboratorio16, intendiamo affrontare parecchie preoccupazioni attuali principali nella metodologia di arricchimento EV: 1) per descrivere una tecnica riproducibile per isolare e purificare EVs ai più alti standard attualmente accettato nel campo; 2) per tentare di isolare piccole sottopopolazioni EV altamente arricchite in endosomal-derivato esosomi; e 3) per fornire un protocollo per l’estrazione di queste vescicole da campioni di tessuto solido ai fini di ulteriore caratterizzazione.
Recentemente, Kowal e colleghi descritti una pendenza di densità relativamente piccoli iodixanol per separare e purificare le sottopopolazioni di EV con maggiore efficacia rispetto paragonabile saccarosio densità gradienti17. Nello studio citato, EVs di derivati da cellule dendritiche catturato in una frazione di densità relativamente leggera, coerenza con una densità di 1,1 g/mL, altamente sono stati arricchiti in proteine endosomal credute di essere più coerente con una proporzione elevata degli esosomi presenti in questo frazione. Secondo gli autori, queste proteine “bona fide” exosomal includevano gene di suscettibilità del tumore 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 e diversi annessina proteine17. Più tardi abbiamo adattato questa tecnica per avere successo un metodo di dissociazione del tessuto descritto da Gonzalez Perez et al.18 e un protocollo di successiva centrifugazione differenziale per isolare l’intero cervello-derivato SVE16. Inoltre, abbiamo dimostrato l’utilità di questo metodo nella caratterizzazione dei proteomi EV combinando un protocollo sequenza per la spettrometria di massa a valle quantitativo e comparativo della proteina vescicolare, precedentemente descritta dal nostro laboratorio19. Questo lavoro era equivalente a quello del laboratorio di Hill, in cui SVE sono state arricchite dalla corteccia frontale del cervello20.
In questo studio, abbiamo elaborato su questa tecnica ed estendere l’applicazione del protocollo recentemente pubblicato dal nostro laboratorio all’isolamento del SVE da tumori solidi del polmone. A nostra conoscenza, questo è il primo studio per descrivere un protocollo per arricchire SVE da ex vivo esemplari del tumore. Visto il diffuso interesse verso EVs come nuovi biomarcatori diagnostici e il loro ruolo nella tumorigenesi, questo metodo probabilmente si rivelerà prezioso per un numero crescente di ricercatori scientifici. Da un punto di vista clinico, EVs interstiziale potrebbe porto grande valore diagnostico, in particolare negli esemplari dove la valutazione istologica è limitata. La nostra speranza è che il metodo descritto qui fornirà un fondamento per una tecnica riproducibile raccogliere EVs in freschi o surgelati umani o animali esemplari chirurgici, spianando la strada per il lavoro futuro scoprire i ruoli significativi nella patogenesi della malattia questi piccoli le vescicole possono giocare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Interesse molto scientifico è stato generato per quanto riguarda i ruoli che piccoli EVs giocare nel microambiente tumorale, come pure in funzione, la maturazione e lo sviluppo dell’organo. Nel complesso, questo studio fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per l’estrazione del SVE intatti da intero cervello o esemplari del tumore. Mentre qui abbiamo semplicemente dimostrare l’applicabilità di questa tecnica per EVs derivate da tumore del polmone, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per lavoro su altri …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dr. Richard Nowakowski e la Florida State University laboratorio animale risorse per fornire e la cura per gli animali utilizzati per sviluppare questo protocollo, rispettosamente. Ringraziamo Liu Xia, Dr. Rakesh Singh e il Florida State University traslazionale Science Laboratory per assistenza con il lavoro di spettrometria di massa utilizzato per la caratterizzazione della vescicola a valle, come pure del fondo per la FSU biologico Scienza Imaging Resource l’utilizzo del microscopio elettronico trasmissione in questo studio. Infine, ringraziamo il dottor Mandip Sachdeva (Florida A & M University) per la donazione degli esemplari del tumore utilizzato nello sviluppo di questo metodo. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma di ricerca di la Florida reparto di salute Ed ed Ethel Moore Alzheimer malattia assegnato a d. G.M. e J.M.O (6AZ11) e il National Cancer Institute, del National Institutes of Health, premio numero R01CA204621 assegnato a d. G.M.
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
Referências
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