Извлечение внеклеточного Vesicles из цельной ткани
Summary
Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции малых внеклеточного везикулы (EVs) от всего тканей, в том числе мозга и опухоли образцов. Этот метод предлагает воспроизводимый метод для извлечения EVs из прочной ткани для дополнительного анализа, ниже по течению.
Abstract
Циркулирующего и интерстициальный малых мембраны прыгните внеклеточного пузырьков (EVs) представляют собой перспективные “мишени” для разработки новых диагностических и прогностических биомаркер анализов и скорее всего служат важными игроками в прогрессировании широкий спектр заболевания. Текущие исследования уделяется характеристике везикулы, выделяется из нескольких клеток и типы тканей для того, чтобы лучше понять роль EVs в патогенезе условий, включая нейродегенеративные, воспаление и рак. Однако глобально последовательную и воспроизводимые методы, чтобы изолировать и очистить везикулы остаются в прогресс. Кроме того едва описаны методы извлечения EVs из прочной ткани ex vivo . Здесь мы предоставляем подробный протокол для извлечения мелких EVs интереса от совершенно свежие или замороженные тканей, в том числе мозга и опухоли образцов, для дальнейшей характеризации. Мы продемонстрировать технологичность этого метода для несколько ниже по течению анализов, включая электронной микроскопии и иммунофенотипических характеристика везикулы, а также количественного масс-спектрометрии белков EV.
Introduction
Малые внеклеточного везикулы (EVs) включают в себя от англ производные exosomes и малых мембраны сарай микровезикулы, которые представляют широкий интерес биомедицинских. Небольшие EVs состоят из гетерогенных населения 50-250 Нм мембраны прыгните везикулы, содержащие биологически активные белки, липиды и нуклеиновых кислот, которые коллективно считается играть важную роль в множество процессов болезни. Продвижение исследований особенно причастны эти пузырьки в нейродегенеративных и прионы расстройств, инфекционные процессы, аутоиммунных или воспалительные условий и роста опухоли и метастазов1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. быстро растущих биомедицинских исследований в значении EVs в патогенезе заболевания параллельных интерес в развитии воспроизводимость и строгие методы для очистки этих пузырьков и изоляции.
Исторической и текущей задачей в EV характеристика была неспособность полностью отделить малых субпопуляций EV. Эта задача во многом из-за нашего ограниченного понимания различных молекулярных механизмов, регулирующих биогенеза отдельных пузырьков. Перекрывающиеся размер, плотность и биологические грузов между субпопуляциями далее convolutes эти различия. Частью этой задачи был также использование широко различные методы обогащения, предоставляя непоследовательность в течению анализе изолированных везикулы лаборатории и подрывает глобальные усилия для освещения категориальной EV населения.
Стоит отметить, что большинство EV характеристика была выполнена в пробирке коллекции клеточной культуры супернатанта, с более недавние исследования в естественных условиях, описывающих методы, чтобы изолировать везикулы из животных или человека жидкости организма, включая плазмы, мочи и слюна. В то время как EVs присутствуют в больших количествах в обращении, она также признала, что эти пузырьки играют важную роль в событиях в ячейке коммуникации и присутствуют в интерстиции клеточных тканей. В контексте рака интерстициальный EVs могут быть особенно важную роль в модуляции микроокружения опухоли раковых клеток посева и метастатический рост14,15. Следовательно есть значение в разработке и оптимизации методов для извлечения пузырьки из прочной ткани образцов. Эти методы будут предоставлять средства непосредственно изучать орган – или опухоль – производные EVs, добываемых из клинических образцов, включая небольшие биопсии и орган полной или частичной резекции.
В этом исследовании и в предыдущем докладе, опубликованном в нашей лаборатории16, мы стремимся решить несколько основных текущих проблем в EV обогащения методологии: 1) для описания воспроизводимый технику, чтобы изолировать и очищают EVs по самым высоким стандартам в настоящее время принятые в этой области; 2) для попытки изолировать малых субпопуляций EV, высоко обогащенный от англ производные exosomes; и 3) представить протокол для извлечения этих везикулы от твердых тканей образцов с целью дальнейшего характеристика.
Недавно Ковал и коллегами описал градиент плотности относительно небольших iodixanol для разделения и очистки EV субпопуляции более эффективно, чем сопоставимые сахарозы плотности градиенты17. В исследовании, цитируется в дендритных клеток, полученных EVs, захвачен в сравнительно малая плотность фракции, в соответствии с плотностью 1,1 г/мл, были высокообогащенного в белки от англ, считается наиболее последовательно с высокой долей exosomes в этом фракция. По мнению авторов эти «bona fide» exosomal белки включены опухоли восприимчивость ген 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 и несколько annexin белков17. Позже мы адаптировали эту технику для достижения успеха метода ткани диссоциации описал Перес Гонсалес et al18 и последующих дифференциального центрифугирования протокол изолировать весь мозг производные EVs16. Мы также продемонстрировали полезность этого метода в характеристике EV протеомов, объединяя последовательный протокол по течению количественное и сравнительного масс-спектрометрии везикулярного белка, ранее описанных в нашей лаборатории19. Эта работа параллельно, что от холма лаборатории, в которой EVs обогатились от лобной коры мозга20.
В этом исследовании мы подробно останавливаться на эту технику и расширить сферу применения протокола, недавно опубликовала от нашей лаборатории для изоляции EVs от опухоли легких твердых. Насколько нам известно это первое исследование, чтобы описать протокол обогатить EVs от ex vivo опухоли образцов. С учетом широкого интереса к EVs как Роман диагностических биомаркеров и их роль в tumorigenesis, этот метод скорее всего окажется ценным для растущего числа научных исследователей. С клинической точки зрения интерстициальный EVs могут гавани диагностики большое значение, особенно в образцах, где ограничена гистологических оценки. Мы надеемся, что метод конспектированный здесь обеспечит основу для воспроизводимых технику урожай EVs из свежих или замороженных животных или человека хирургической образцов, в почву для будущей работы раскрыть существенную роль в патогенезе заболеваний этих малых пузырьки могут играть.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гораздо научный интерес был создан относительно роли, которую малые EVs играть микроокружения опухоли, а также в орган развития, созревания и функции. В целом это исследование обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для извлечения нетронутыми EVs от весь мозг или образцы опухоли. Х…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-р Ричард Новаковский и Флорида государственного университета лабораторных животных ресурсов для предоставления и заботы о животных, используемых для разработки этого протокола, с уважением. Мы благодарим Лю ся, доктор Ракеш Сингх и Флорида государственного университета трансляционная научная лаборатория для помощи с работой масс-спектрометрии для вниз по течению везикул характеристик, а также БСС биологических наук Imaging ресурсов Фонда для Использование просвечивающий электронный микроскоп в этом исследовании. Наконец мы благодарим д-р Mandip Сачдева (Флорида A & M университет) за пожертвование в размере опухоли образцов, используемых в разработке этого метода. Это исследование было поддержано грантов от Флорида Департамента здравоохранения Эд и Этель Мур Альцгеймера болезнь исследовательской программы награждены D.G.M. и J.M.O (6AZ11) и национального института рака национальных институтов здоровья под номером премии Вручена D.G.M. R01CA204621
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
Referências
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer’s disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
- Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
- Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
- Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
- Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
- Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
- Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
- Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
- Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
- Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes – large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).
