استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة
Summary
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لعزل حويصلات خارج الخلية الصغيرة (EVs) من الأنسجة كاملة، بما في ذلك عينات المخ والورم. ويوفر هذا الأسلوب أسلوب استنساخه لاستخراج المركبات الكهربائية من الأنسجة الصلبة للمزيد من التحليلات المتلقين للمعلومات.
Abstract
تعميم والمتداخلة الصغيرة الغشاء زمنياً خارج الخلية حويصلات (EVs) تمثل أهداف واعدة لتطوير فحوصات رواية العلامات البيولوجية التشخيص أو تشخيصية، ويرجح أن تكون بمثابة جهات فاعلة هامة في التقدم من طائفة واسعة من الأمراض. تركز الأبحاث الحالية على توصيف حويصلات تفرز من خلايا متعددة وأنواع الأنسجة بغية تحسين فهم دور المركبات الكهربائية في الآلية المرضية للشروط بما في ذلك نيوروديجينيريشن، والالتهابات، والسرطان. ومع ذلك، تظل أساليب متسقة على الصعيد العالمي واستنساخه لعزل وتنقية حويصلات في التقدم. وعلاوة على ذلك، نادراً ما يتم وصف طرق لاستخراج المركبات الكهربائية من الأنسجة الصلبة السابقين فيفو . هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخراج المركبات الكهربائية الصغيرة لمصلحة من الأنسجة كاملة الطازجة أو المجمدة، بما في ذلك عينات المخ والورم، لمزيد من الوصف. علينا أن نظهر قدرة التكيف مع هذا الأسلوب لتحليلات المصب متعددة، بما في ذلك الميكروسكوب الإلكتروني وتوصيف إيمونوفينوتيبيك من حويصلات، وكذلك الكمية الكتلي من البروتينات EV.
Introduction
وتشمل حويصلات صغيرة خارج الخلية (EVs) المستمدة من اندوسومال اكسوسوميس وميكروفيسيكليس الغشاء-تسلط الصغيرة التي من مصلحة الطب الأحيائي الواسع. المركبات الكهربائية الصغيرة تتكون من عدد السكان غير متجانسة من 50-250 نانومتر غشاء زمنياً الحويصلات المحتوية على البروتينات النشيطة بيولوجيا والدهون والأحماض النووية التي يعتقد أنها مجتمعة على القيام بأدوار هامة في العديد من عمليات المرض. النهوض بالبحوث وبخاصة قد تورط هذه الحويصلات في الأعصاب واضطرابات بريون، العمليات المعدية والظروف الذاتية أو التحريضية، ونمو الورم وورم خبيث1،،من23 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-البحوث الطبية الحيوية التي تنمو بسرعة إلى أهمية المركبات الكهربائية في إمراضية المرض قد أثارت الاهتمام الموازي في تطوير أساليب استنساخه وصارمة لعزل وتنقية هذه الحويصلات.
وكان تحدي التاريخي والحالي في توصيف EV عدم القدرة على فصل الفئات السكانية الفرعية EV الصغيرة تماما. هذا التحدي إلى حد كبير نتيجة لفهمنا المحدود للآليات الجزيئية المختلفة التي تحكم نشوء حيوي حويصلات متميزة. تداخل في الحجم والكثافة والشحنات بيولوجي بين الفئات السكانية الفرعية كذلك كونفولوتيس هذه الفروق. وكان جزءا من هذا التحدي أيضا استخدام اختلاف تقنيات تخصيب اليورانيوم على نطاق واسع، وتوفير عدم تناسق في تحليل المتلقين للمعلومات من الحويصلات المعزولة عبر المختبرات وتقويض الجهود العالمية لإلقاء الضوء على القاطع EV السكان.
تجدر الإشارة إلى أن غالبية توصيف EV قد أنجز من جمع في المختبر لخلية ثقافة طافية، مع أكثر حداثة الدراسات المجراة في وصف تقنيات لعزل حويصلات من سوائل جسم الحيوان أو الإنسان، بما في ذلك البلازما، البول ، واللعاب. بينما المركبات الكهربائية موجودة بكميات كبيرة في الدورة الدموية، كما أقر بأن هذه الحويصلات تلعب أدواراً هامة في أحداث خلية لخلية الاتصال وموجودة في إينتيرستيتيوم الأنسجة الخلوية. في السياق السرطان، قد تكون المركبات الكهربائية المتداخلة أهمية خاصة في تحوير وورم المكروية للخلايا السرطانية البذر والنمو المنتشر14،15. ونتيجة لذلك، هناك قيمة في تطوير وتحسين تقنيات استخراج حويصلات من عينات الأنسجة الصلبة. هذه الأساليب سوف توفر وسيلة لمباشرة دراسة الجهاز-أو الورم المشتقة من المركبات الكهربائية التي تحصد من العينات السريرية، بما في ذلك الخزعات الصغيرة وريسيكشنز الجهاز الجزئي أو الكامل.
في هذه الدراسة، وفي تقرير سابق نشرته لدينا مختبر16، نحن نهدف إلى معالجة العديد من الشواغل الرئيسية الحالية في منهجية الإثراء EV: 1) لوصف تقنية استنساخه لعزل وتنقية المركبات الكهربائية بأعلى معايير حاليا قبلت في هذا الميدان؛ 2) في محاولة لعزل الفئات السكانية الفرعية الصغيرة EV عالي التخصيب في اكسوسوميس المستمدة من اندوسومال؛ و 3) تقديم بروتوكول لاستخراج هذه الحويصلات من عينات الأنسجة الصلبة غرض مزيد من الوصف.
في الآونة الأخيرة، وصف Kowal والزملاء تدرج كثافة إيوديكسانول صغيرة نسبيا لفصل وتنقية EV الفئات السكانية الفرعية بفعالية أكبر من السكروز مقارنة كثافة التدرجات17. في الدراسة المذكورة، والمركبات المستمدة من الخلايا الجذعية استولت في كسر كثافة خفيفة نسبيا، اتساقا مع كثافة 1.1 غ/مل، تم التخصيب في البروتينات اندوسومال ويعتقد أن يكون أكثر اتساقا مع نسبة عالية من اكسوسوميس في هذا كسر. وشملت هذه البروتينات اكسوسومال “حسن النية” وفقا للمؤلفين، الورم قابلية الجينات 101 (TSG101)، سينتينين-1، CD81، ADAM10، EHD4، والعديد من البروتينات أنيكسين17. ونحن في وقت لاحق تكييف هذا الأسلوب أن ينجح أسلوب تفكك النسيج التي وصفها جونزاليز بيريز وآخرون18 وبروتوكول الطرد المركزي تفاضلي لاحقة لعزل المركبات الكهربائية المستمدة من الدماغ كله16. كما أظهرنا في جدوى هذا الأسلوب في وصف بروتيوميس EV بالجمع بين بروتوكول متسلسلة للمتلقين للمعلومات الكمية والنسبية الكتلي للبروتين حويصلية، الموصوفة سابقا لدينا مختبر19. توازي هذا العمل أن من المختبر هيل، الذي كانت أثري المركبات الكهربائية من قشرة المخ20أمامي.
في هذه الدراسة، وضع على هذا الأسلوب، وتوسيع نطاق تطبيق البروتوكول نشرت مؤخرا من المختبر لعزل المركبات الكهربائية عن أورام الرئة صلبة. على حد علمنا، هذا هو أول دراسة لوصف وضع بروتوكول لإثراء المركبات الكهربائية من السابقين فيفو الورم العينات. ونظرا للاهتمام الواسع النطاق في المركبات الكهربائية كرواية المؤشرات الحيوية التشخيصية ودورها في توموريجينيسيس، هذا الأسلوب يحتمل أن يتضح أن قيمة بالنسبة لعدد متزايد من الباحثين العلميين. من وجهة نظر سريرية، يمكن إيواء المركبات الكهربائية المتداخلة قيمة تشخيصية كبيرة، لا سيما في العينات حيث يقتصر تقييم نسيجية. وأملنا أن الأسلوب المبين هنا سيوفر أساس لتقنية استنساخه لحصاد المركبات الكهربائية من الطازجة أو المجمدة الحيوانية أو البشرية الجراحية العينات، مما يمهد الطريق للعمل في المستقبل لكشف الأدوار الهامة في إمراضية المرض هذه الصغيرة وقد لعب حويصلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم إنشاؤها الاهتمام العلمي كثيرا فيما يتعلق بالأدوار التي تلعب المركبات الكهربائية الصغيرة في ورم المكروية، وكذلك في تطوير الجهاز والنضج، والدالة. وتوفر هذه الدراسة الشاملة، سير العمل أمثل لاستخراج المركبات الكهربائية سليمة من الدماغ كله أو عينات من الورم. بينما هنا نحن ببساطة توضح إمك?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور ريتشارد نوواكووسكي والموارد الحيوانية فلوريدا دولة جامعة المختبر لتقديم ورعاية الحيوانات المستخدمة لوضع هذا البروتوكول، مع الاحترام. ونحن نشكر ليو شيا والدكتور راكيش سينغ، وفلوريدا دولة جامعة متعدية علوم المختبر للمساعدة مع عمل الكتلي المستخدمة لوصف حويصلة المتلقين للمعلومات، فضلا عن مرفق “الموارد التصوير العلوم البيولوجية الاتحاد السوفياتي السابق” في استخدام المجهر الإلكتروني الإرسال في هذه الدراسة. وأخيراً، نشكر الدكتور ومانديب ساشديفا (فلوريدا جامعة أية آند أم) للتبرع بورم في العينات المستخدمة في تطوير هذا الأسلوب. هذه الدراسة كانت تدعمها المنح من “برنامج البحوث” بفلوريدا وزارة الصحة اد واثيل مور الزهايمر المرض الممنوحة إلى D.G.M. و J.M.O (6AZ11) والمعهد الوطني للسرطان من “المعاهد الوطنية للصحة” تحت “رقم جائزة” R01CA204621 إلى D.G.M.
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
Referências
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Howitt, J., Hill, A. F. Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases. Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).
- Sardar Sinha, M., et al. Alzheimer’s disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers. Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).
- Meckes, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).
- Meckes, D. G. Exosomal communication goes viral. Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Zhang, X., et al. Exosomes in cancer: small particle, big player. Journal of Hematology Oncology. 8, 83 (2015).
- Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).
- Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses. Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).
- Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Katsiougiannis, S. Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity. Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space. Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).
- Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling. Journal of Virology. 91 (5), (2017).
- Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295 (2016).
- Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. Journal of Visualized Experiments. (59), e3037 (2012).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).
- Meckes, D. G. Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).
- Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978 (2016).
- Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nature Communications. 2, 180 (2011).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Zijlstra, A., Di Vizio, D. Size matters in nanoscale communication. Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).
- Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. Oncosomes – large and small: what are they, where they came from. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109 (2016).
