Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe
Summary
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.
Abstract
Zirkulierenden und interstitielle kleine Membrane-springen extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen viel versprechende Ziele für die Entwicklung von neuartigen diagnostische oder prognostische Biomarker Assays und wahrscheinlich dienen als wichtige Akteure bei der Progression von ein breites Spektrum von Krankheiten. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung von Vesikeln aus mehreren Zelle sezerniert und Gewebetypen um besser zu verstehen, welche Rolle der EVs in der Pathogenese der Bedingungen, einschließlich Neurodegeneration, Entzündungen und Krebs. Bleiben jedoch weltweit konsistente und reproduzierbare Techniken zu isolieren und reinigen Vesikel im Gange. Darüber hinaus werden Methoden zur Gewinnung von EVs aus festen Gewebe ex Vivo kaum beschrieben. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Extrahieren von kleinen EVs von Interesse aus ganz frischen oder gefrorenen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zur weiteren Charakterisierung. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit dieser Methode für mehrere nachgeschaltete Analysen, einschließlich Elektronenmikroskopie und Immunophenotypic Charakterisierung von Vesikeln sowie quantitative Massenspektrometrie EV Proteine.
Introduction
Kleinen extrazelluläre Vesikel (EVs) gehören Endosomal abgeleitet Exosomen und kleine Membran-Schuppen-Microvesicles, die von breiten biomedizinischen Interesse sind. Kleinen EVs bestehen aus einer heterogenen Bevölkerung von 50-250 nm Membrane-springen Vesikeln mit biologisch aktiven Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die kollektiv geglaubt werden, um in einer Vielzahl von Krankheiten eine wichtige Rolle spielen. Förderung der Forschung hat diese Vesikel in Neurodegenerative und Prion-Erkrankungen, infektiöse Prozesse, Autoimmun- oder entzündlichen Bedingungen und Tumorwachstum und Metastasierung1,2,3 besonders verwickelt. , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. schnell wachsenden biomedizinischen Forschung in die Bedeutung der EVs in der Pathogenese der Krankheit hat parallel Interesse an der Entwicklung reproduzierbarer und rigoroser Methoden zur Isolierung und Reinigung von diesen Bläschen erzeugt.
Eine historische und aktuelle Herausforderung in EV Charakterisierung wurde die Unfähigkeit, kleine EV Subpopulationen vollständig zu trennen. Diese Herausforderung ist im Wesentlichen auf unser begrenztes Verständnis der unterschiedlichen molekularen Mechanismen für die Biogenese von unterschiedlichen Vesikeln. Überlappende Größe, Dichte und biologischen Fracht zwischen Subpopulationen weitere Umdrehungen diese Unterscheidungen. Teil dieser Herausforderung wurde auch die Verwendung weit unterschiedliche Anreicherung Techniken, Inkonsistenz in nachgelagerte Analyse der isolierten Vesikel in Laboratorien und aufrechtzuerhalten, und untergräbt die globale Anstrengungen zur kategorische EV Populationen zu beleuchten.
Es ist erwähnenswert, dass die Mehrheit der EV Charakterisierung von in-vitro-Sammlung der Zellkultur überstand, mit neueren Studien in vivo Beschreibung Techniken zur Isolierung von Vesikeln aus tierischen oder menschlichen Körperflüssigkeiten, einschließlich Plasma, Urin durchgeführt wurde , und Speichel. EVs in großen Mengen im Umlauf sind, erkannte sie auch, dass diese Vesikel spielen eine wichtige Rolle in der Zell-Zell-Kommunikationsveranstaltungen und in das Interstitium der zellulären Gewebe vorhanden sind. In Zusammenhang mit Krebs möglicherweise interstitielle EVs Modulation der Tumor Mikroumgebung für Krebszelle Aussaat und metastasiertem Wachstum14,15besonders wichtig. Infolgedessen gibt es Wert bei der Entwicklung und Optimierung von Techniken, um Bläschen aus soliden Gewebeproben zu extrahieren. Diese Methoden bieten eine Möglichkeit direkt Orgel – Studium oder Tumor – EVs geerntet von klinischen Proben, einschließlich kleinen Biopsien und teilweise oder vollständige Orgel Resektionen abgeleitet.
In dieser Studie und in einem früheren Bericht, herausgegeben von unserem Labor16wollen wir mehrere wichtige aktuelle EV Bereicherung Methodik Bedenken: 1) um eine reproduzierbare Technik zu isolieren und reinigen EVs nach den höchsten Standards derzeit zu beschreiben auf dem Fachgebiet anerkannt; (2) zu versuchen, kleine EV Subpopulationen hochangereichertes im Endosomal abgeleitet Exosomen zu isolieren; und 3), ein Protokoll für die Gewinnung von diesen Bläschen aus massivem Gewebeproben zur weiteren Charakterisierung zur Verfügung zu stellen.
Vor kurzem, Kowal und Kollegen beschrieben eine relativ kleine Iodixanol Dichtegradient zu trennen und zu reinigen EV Subpopulationen mit größerer Wirksamkeit als vergleichbare Saccharose Dichte Gradienten17. In der zitierten Studie wurden dendritische Zelle abgeleitet EVs, eingefangen in Sekundenbruchteilen relativ geringer Dichte, mit einer Dichte von 1,1 g/mL, in Endosomal Proteine als konsequenteste mit einem hohen Anteil von Exosomen vorhanden in diesem hochangereichertes Bruchteil. Nach Ansicht der Autoren enthalten dieser “bona fide” Exosomal Proteine Tumor Anfälligkeit gen 101 (TSG101), Syntenin-1, CD81 ADAM10, EHD4 und mehrere annexin Proteine17. Diese Technik, um eine Methode der Gewebe Dissoziation von Perez Gonzalez Et al.18 und eine nachfolgende differentielle Zentrifugation Protokoll zum ganzen Gehirn abgeleitet EVs16isolieren beschrieben gelingt später angepasst Wir zeigten auch die Nützlichkeit dieser Methode bei der Charakterisierung EV Proteome durch die Kombination eine sequenzielle Protokoll für nachgeschaltete quantitative und vergleichende Massenspektrometrie vesikuläre Protein, zuvor von unserem Labor19beschrieben. Diese arbeiten parallel, die aus dem Hill-Labor, in dem EVs aus der frontalen Kortex des Gehirns20angereichert wurden.
In dieser Studie wir näher auf diese Technik und die Anwendung des Protokolls vor kurzem von unserem Labor auf die Isolation der EVs aus massivem Lungentumoren zu verlängern. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie zu beschreiben, ein Protokoll zur EVs aus ex-Vivo Tumor Proben zu bereichern. Das breite Interesse im Rahmen des EFD als neuartige diagnostischen Biomarkern und ihre Rolle in der Tumorgenese gegeben, wird diese Methode wahrscheinlich für eine wachsende Zahl von wissenschaftlichen Forscher wertvoll erweisen. Aus klinischer Sicht könnte interstitielle EVs großen diagnostischen Wert, vor allem bei Exemplaren Hafen wo histologische Auswertung begrenzt ist. Unsere Hoffnung ist, dass die hier beschriebene Methode eine Grundlage für eine reproduzierbare Technik EVs aus frischen oder gefrorenen tierischen oder menschlichen chirurgische Proben, ebnet den Weg für die künftige Arbeit aufzudecken die bedeutende Rolle in der Pathogenese der Krankheit diese kleine Ernte Bläschen können spielen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viel wissenschaftliches Interesse wurde im Hinblick auf die Rollen, die kleine EVs in der Mikroumgebung Tumor sowie in Organentwicklung, Reifung und Funktion spielen generiert. Insgesamt bietet diese Studie einen optimierten Workflow für die Gewinnung von intakten EVs aus Gesamt-Hirn oder Tumor Proben. Während hier wir einfach die Anwendbarkeit dieser Technik auf Lunge Tumor abgeleitet EVs zeigen, könnte diese Methode einfach angepasst werden für die Arbeit auf anderen festen Geweben, Möglichkeiten für weitere Ex V…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Richard Nowakowski und die Florida State University Labor Tier Ressourcen für die Bereitstellung und Pflege für die Tiere zu diesem Protokoll respektvoll zu entwickeln. Wir danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh und Florida State University translationale Science Laboratory für Hilfe mit der Massenspektrometrie Arbeit zur nachgelagerten Vesikel Charakterisierung sowie die FSU Biological Science Imaging Resource-Anlage für die Verwendung des Transmissions-Elektronenmikroskop in dieser Studie. Zu guter Letzt danken wir Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) für die Spende der Tumor Proben bei der Entwicklung dieser Methode verwendet. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Florida Department of Health Ed und Ethel Moore Alzheimer Krankheit Forschungsprogramm an D.G.M. und J.M.O (6AZ11) und das National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Prämiennummer vergeben R01CA204621 an D.G.M. vergeben
Materials
| 0.45 µm filter | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix antibody | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin antibody | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| anti-CD81 antibody | Santa Cruz | sc-9158 | |
| anti-Flotillin 2 antibody | Santa Cruz | sc-25507 | |
| anti-HSC70 antibody | Santa Cruz | sc-7298 | |
| anti-Syntenin-1 antibody | Santa Cruz | sc-100336 | |
| anti-TSG101 antibody | Santa Cruz | sc-7964 | |
| Dounce homogenizer | DWK Life Sciences | 885300-0015 | Loose-fit pestle (clearance of 0.889–0.165 mm) used. |
| EZQ protein quantification kit | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 rotor | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 Electron Microscope | TSS Microscopy | ||
| goat anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Optima XE-100 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Optiprep | Sigma | D1556 | 60% iodixanol in sterile water solution |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | ||
| rabbit anti-goat IgG | Genetex | 26741 | |
| rabbit anti-mouse IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (refractometer) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 rotor | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti swinging-bucket Rotor | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
Referências
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