Na differentiatie Herbeplating van menselijke pluripotente stamcel afkomstige neuronen voor het screenen van hoge inhoud van Neuritogenese en Synapse rijping
Summary
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor het resuspenderen en kweken van menselijke stamcel afgeleide neuronen die eerder werden onderscheiden van neurale voorlopercellen in vitro voor meerdere weken. De procedure vergemakkelijkt op beeld gebaseerde assays van neurites, synapsen, en laat-uitdrukken neuronale markers in een formaat dat compatibel is met lichte microscopie en High-content screening.
Abstract
Neuronen onderscheiden in tweedimensionale cultuur van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide neurale voorlopercellen (Npc’s) vormen een krachtig modelsysteem om ziekte mechanismen te onderzoeken en High content screening (HC’S) uit te voeren voor interrogaat verbinding bibliotheken of Identificeer genmutatie fenotypes. Echter, met menselijke cellen de overgang van NPC naar functioneel, volwassen neuron vereist enkele weken. Synapsen beginnen meestal te vormen na 3 weken van differentiatie in monolaag cultuur, en verschillende neuron-specifieke eiwitten, bijvoorbeeld de later uitdrukken pan-neuronale marker neun, of de laag 5/6 cerebrale corticale neuron marker CTIP2, beginnen te uiten ongeveer 4-5 weken na differentiatie. Deze lange differentiatie tijd kan onverenigbaar zijn met optimale cultuuromstandigheden die worden gebruikt voor kleine volumes, multi-well HCS-platformen. Onder de vele uitdagingen zijn de behoefte aan goed-nageleefd, uniform verdeelde cellen met minimale celclustering, en cultuur procedures die lange termijn levensvatbaarheid en functionele Synapse rijping bevorderen. Een benadering is het differentiëren van neuronen in een groot volume formaat, en ze vervolgens opnieuw op een later tijdstip in HCS-compatibele multi-Wells. Enkele belangrijke uitdagingen bij het gebruik van deze replating aanpak betreffen reproduceerbaarheid en de levensvatbaarheid van de cel, als gevolg van de stressvolle verstoring van het dendritische en axonale netwerk. Hier demonstreren we een gedetailleerde en betrouwbare procedure voor enzymatisch resuspenderende menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen na hun differentiatie voor 4-8 weken in een groot volume formaat, overbrengen naar 384-well micro titer platen, en kweek ze voor nog eens 1-3 weken met uitstekende overleving van de cel. Deze replating van menselijke neuronen kan niet alleen de studie van Synapse assemblage en rijping binnen twee weken na het replating, maar maakt ook studies van neuriet regeneratie en groei kegel kenmerken. We bieden voorbeelden van schaalbare assays voor neuritogenesis en synaptogenese met behulp van een 384-well platform.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleide neuronen worden steeds relevanter op het gebied van fundamenteel onderzoek, Geneesmiddelenontwikkeling en regeneratieve geneeskunde. Workflows en procedures om hun cultuur en onderhoud te optimaliseren en de efficiëntie van differentiatie in specifieke neuronale subtypen te verbeteren, evolueren snel1,2. Om het nut en de kosteneffectiviteit van menselijke stamcel afkomstige neuronen te verbeteren als modelsystemen die vatbaar zijn voor analyses met een hoog gehalte in geneesmiddelen ontdekking en doel validatie, is het nuttig om de kweektijd te verlagen die nodig is voor het genereren van volwassen, functionele neuronen, met behoud van maximale robuustheid, reproduceerbaarheid en fenotype relevantie. Hoewel 3-dimensionale organoïde-culturen doorbraken in neuroontwikkelingsonderzoek rijden, zijn 2-dimensionale monolaag-culturen met name compatibel met geautomatiseerde beeldvormings toepassingen vanwege hun minimale weefsel dikte.
Echter, de aanpassing van Imaging-gebaseerde screeningmethoden aan modellen van menselijke neurologische en neuroontwikkelingsziekte wordt geconfronteerd met een grote uitdaging. Het langdurige tijdsbestek waarover het menselijk zenuwstelsel in vivo rijpt, vereist uitgebreide tijd in cultuur om tegemoet te komen aan natuurlijke Programma’s van genexpressie en neuronale rijping te bereiken.
Een praktisch gevolg van het lange neuronale differentiatie programma is dat het onderhoud van de met hipsc afgeleide monolaag culturen gedurende vele weken moet worden gehandhaafd om een adequate Synapse maturiteit te bereiken. Gedurende deze tijd, neurale voor ouders die ongedifferentieerde blijven blijven verdelen. Deze kunnen de cultuur snel overgroeien en de nutriënten-inhoud die nodig is om levensvatbare postmitotische neuronen te behouden. Krachtig verdelen neurale voorlopercellen (Npc’s) kan ook concurreren met neuronen voor de groei substraat. Hierdoor kunnen dergelijke culturen worden onderworpen aan problemen met een slechte hechting, een aandoening die ongeschikt is voor op beeldvorming gebaseerde assays. Bovendien vinden veel onderzoekers dat hoe kleiner het cultuur volume, hoe groter de moeilijkheid bij het handhaven van gezonde populaties van gedifferentieerde neuronen lang genoeg om de late stadia van neuronale differentiatie te observeren. Met andere woorden, assays van Synapse rijping met behulp van High content screening (HCS) benaderingen kunnen zeer uitdagend voor menselijke-afgeleide neuronen.
Om sommige van deze problemen te omzeilen, is een procedure voor het opnieuw opschorten en replating van eerder gedifferentieerde hiPSC-afgeleide neuronen gebruikt. Ten eerste, het maakt de studie van neuriet uitgroei (of, nauwkeuriger, neuriet regeneratie) in een populatie van volledig betrokken neuronen. Ten tweede, de herbeplating van eerder gedifferentieerde neuronen uit een groot volume formaat (zoals 10 cm platen of groter), tot kleine volume formaten (zoals HCS-compatibele 96-of 384-well microtiterplaten) maakt een significante reductie in de totale kweektijd in de kleine volume conditie. Dit vergemakkelijkt de studie van Synapse assemblage en rijping in de daaropvolgende weken in vitro.
Echter, de replating van volwassen neuronen die al hebben vastgesteld lange neurites en een complex connectiviteits netwerk presenteert verschillende uitdagingen, waarvan één is de soms hoge en variabele snelheid van celdood. Hier beschrijven we een replating procedure die resulteert in uitstekende celoverleving en reproduceerbaarheid. Gewoonlijk worden neuronen blootgesteld aan Proteolytische enzymen voor korte incubatie perioden (meestal ~ 3-10 min) om cellen los te maken van het substraat voorafgaand aan de trituratie. Deze korte proteolyse tijd wordt gewoonlijk gebruikt voor het resuspenderen en doorvoeren van vele soorten scheidings cellen, waaronder niet-neuronale cellen en ongedifferentieerde voor ouders4,5,6. Echter, voor gedifferentieerde neuronen met lange, onderling verbonden neurites, is het essentieel niet alleen om cellen los te koppelen van het substraat, maar ook om het dendritische en axonale netwerk te verstoren om individuele cellen te isoleren terwijl de schade wordt geminimaliseerd. Inderdaad, een dik gevlochten van neuronen meestal de neiging om los te koppelen van het substraat als een enkel blad, in plaats van als individuele cellen. Als er geen zorg wordt genomen om het dikke netwerk van neurites los te maken, worden neuronen niet alleen onomkeerbaar beschadigd tijdens de trituratie, maar velen van hen verzuimen het filter te passeren dat wordt gebruikt om klonten te verwijderen, wat resulteert in een slechte celopbrengst. Hieronder beschrijven we een eenvoudige wijziging van een veelgebruikte incubatie procedure voor protease om deze moeilijkheden tegen te gaan.
In het hieronder beschreven protocol worden neuronen gedurende 40-45 minuten geïnnobeerd met een milde protease, zoals het Proteolytische enzym (bijv. Accutase). Tijdens de eerste 5-10 min na het toevoegen van het enzym, het neuronale netwerk Tilt van de ondergrond als een blad. De incubatie met de protease gaat nog 30-40 minuten mee voordat de zachte trituratie en filtering wordt voortgezet. Deze extra incubatietijd zorgt ervoor dat de vertering van het materiaal het intercellulaire netwerk ontspant, zodat de daaropvolgende trituratie een suspensie van individuele cellen oplevert. Deze procedure maximaliseert de uniformiteit van de celverdeling bij het replating, terwijl de celdood wordt geminimaliseerd. We hebben deze replating methode met succes toegepast op door hipsc afgeleide neuronale culturen, gegenereerd door verschillende differentiatie protocollen7,8 en verschillende lijnen van hipscs. De procedure is nominaal geschikt voor gebruik met de meeste of alle lijnen van stamcel afgeleide neuronen. We hebben geconstateerd dat een verlengde incubatietijd van de protease niet absoluut noodzakelijk is voor het replating van culturen uit kleine formaat platen (bijv. 35 mm diameter); echter, zoals we hier laten zien, biedt het een significant voordeel bij het replating van platen met grote diameter (bijv. 10 cm diameter of groter), waarschijnlijk omdat neurites in dergelijke platen zeer lange processen kunnen verlengen en een dicht met elkaar verbonden array vormen.
Hier demonstreren we deze methode en illustreren kort de toepassing ervan in assays voor vroege neuritogenesis en voor Synapse rijping, waarbij clustering van pre-en postsynaptisch eiwitten langs de dendrieten en axonen, gevolgd door hun latere colokalisatie op synaptische sites. De voorbeelden wijzen op de voordelen die dit protocol biedt bij het behoud van de levensvatbaarheid en reproduceerbaarheid van cellen. Ten eerste staat het onderzoekers toe om vroege stappen in menselijke neuritogenese te bestuderen. De experimentele instelling is vergelijkbaar met de veelgebruikte primaire culturen van knaagdieren corticale of hippocampal neuronen, waar cellen worden geëxtraheerd uit de late foetale of vroege postnatale hersenen, gezien door trituratie na milde protease behandeling, en toegestaan om te initieert neurites of regenereren neurites die in de procedure9,10werden verbroken. Vergelijkbaar met dergelijke knaagdieren primaire neuronen, hiPSC-afgeleide neuronen beginnen te vormen of hun neurites regenereren binnen enkele uren na het replating, waardoor Imaging van groei kegels en neuriet morfologie in een omgeving die optimaal is voor hoge spatiotemporele beeldvorming met minder Omringende ongedifferentieerde cellen. We hebben geconstateerd dat neuriet uitgroei is meer gesynchroniseerd in vergelijking met de variabele vertragingen en verschillende uitgroei percentages gezien wanneer neuronen beginnen te onderscheiden van een voorlopercellen populatie. Bovendien, replating maakt assays van neuronen die neuronale subtype markeringen die meestal verschijnen later in neurale ontwikkeling, zoals de corticale laag 5/6 transcriptiefactor CTIP2 (kip ovalbumine upstream Promoter transcriptie factor-interactie eiwit 2), of de pan-neuronale marker NeuN11. Een bijzonder nuttig kenmerk van de replating aanpak is dat synaptogenese verloopt binnen een tijdsbestek compatibel met HCS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij hebben blijk gegeven van een rechtlijnig proces voor de resuspensie en herbeplating van menselijke neuronale culturen die de levensvatbaarheid, het succes van differentiatie en de subcellulaire beeldvorming optimaliseren op een manier die verenigbaar is met platforms voor het screenen van hoge inhoud, en andere assays die relevant zijn voor de opsporing van geneesmiddelen. Figuur 6 illustreert de algemene workflow en voorbeelden van dergelijke toepassingen.
Ho…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk is een onderdeel van de nationale coöperatieve geherprogrammeerde Celonderzoeksgroepen (NCRCRG) om psychische aandoeningen te bestuderen en werd ondersteund door NIH Grant U19MH1 2015-0644. Het initiële werk werd ook ondersteund door NIH Grant NS070297. We bedanken drs. Carol Marchetto en Fred Gage, het Salk Institute, voor het leveren van de WT 126 lijn van neurale voorlopercellen, en Drs. Eugene Yeo en Lawrence Goldstein, UC San Diego voor het verstrekken van de CVB WT24 lijn van neurale voorlopercellen. We bedanken Deborah pre in het laboratorium van Dr. Anne bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, voor nuttige discussies.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
Referências
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Langdon, S. P. . Cancer Cell Culture. , (2010).
- Picot, J. . Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
