לאחר בידול מחדש של תא גזע האדם Pluriפוטנטי-הנוירונים הנגזרים עבור הקרנת תוכן גבוה של Neuritogenesis והתבגרות סינפסה
Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט עבור השעיית מחדש ו culturing תא גזע אנושי נגזר שהיו הבדיל בעבר מושלתי עצביים בתוך מבחנה במשך שבועות מרובים. ההליך מאפשר הדמיה מבוססי מבוסס על neurites, סינפסות, וסמנים מאוחר ביטוי עצבי בפורמט תואם עם מיקרוסקופ אור והקרנת תוכן גבוה.
Abstract
נוירונים הבדיל בתרבות דו מימדית מפני הגזע האנושי האנטי-עוצמה הנגזר של התאים (NPCs) מייצגים מערכת מודל רבת עוצמה כדי לחקור מנגנוני מחלות ולבצע הקרנת תוכן גבוה (HCS) כדי לחקור תרכובת ספריות או לזהות פנוטיפים מוטציה של גנים. עם זאת, עם התאים האנושיים המעבר NPC כדי פונקציונלי, בוגרת תא העצב דורש מספר שבועות. הסינפסות בדרך כלל להתחיל להיווצר לאחר 3 שבועות של בידול בתרבות דופלקס, ומספר חלבונים ספציפיים לעצב, למשל מאוחר יותר המבטא פאן-עצבי סמן neun, או השכבה 5/6 מוחין תא העצב הקליפת המוח סמן CTIP2, להתחיל לבטא סביב 4-5 שבועות לאחר בידול. זמן זה בידול ארוך יכול להיות בלתי תואם עם תנאי התרבות האופטימלית המשמש נפח קטן, multi-היטב פלטפורמות HCS. בין האתגרים הרבים הינם הצורך בתאים מבוזרים ומפוזרים בצורה אחידה עם אשכולות תאים מינימליים, והליכי תרבות המאומצים על הכדאיות ארוכת הטווח וההבשלה הפונקציונלית של הסינפסה. גישה אחת היא להבדיל נוירונים בפורמט גדול נפח, ואז לשחזר אותם בשלב מאוחר יותר ב HCS תואם multi-בארות. כמה אתגרים עיקריים כאשר משתמשים בגישה זו ציפוי מחדש מודאג הכדאיות ויכולת התאים, בשל שיבוש מלחיץ של רשת הדנדריטים והאקונאליות. כאן אנו מדגימים הליך מפורט ואמין עבור השעיית האדם המושרה בצורה מבחינה אנזיבית (היפנוטית)-נגזר הנוירונים לאחר הבידול שלהם עבור 4-8 שבועות בפורמט גדול של נפח, העברת אותם 384-היטב microtiter צלחות, ו culturing אותם לעוד 1-3 שבועות עם הישרדות תא מעולה. זה ציפוי מחדש של נוירונים אנושיים לא רק מאפשר את המחקר של הרכבה סינפסה בתוך שבועיים מחדש, אבל גם מאפשר מחקרים של התחדשות neurite ומאפיינים חרוט הצמיחה. אנו מספקים דוגמאות של asuritogenesis ו synaptogenesis באמצעות פלטפורמת 384-היטב.
Introduction
תא גזע האדם בעוצמה מרבית (היפנוטית)-הנוירונים הנגזרים רלוונטיים יותר ויותר בתחומים של מחקר בסיסי, פיתוח סמים, ורפואה משובי. זרימות עבודה ופרוצדורות כדי לייעל את התרבות שלהם ואת התחזוקה, ולשפר את היעילות של בידול לתוך תת נוירואליות ספציפיים, מתפתחים במהירות1,2. כדי לשפר את השירות ואת עלות האפקטיביות של תאי גזע האדם הנגזרים הנוירונים כמו מערכות מודל הקלה לניתוח תוכן גבוה בגילוי סמים ואימות היעד, זה שימושי כדי להקטין את זמן culturing הנדרש כדי ליצור בוגרת, פונקציונלי נוירונים, תוך שמירה על החוסן המקסימלי, התוכסות, ו-פנוטיפ. למרות תרבויות תלת ממדיות אורגנואיד הם הנהיגה פריצות דרך במחקר נוירופיתוח מחקר3, 2-מימדי התרבויות תואמות במיוחד עם יישומים מבוססי הדמיה אוטומטית בשל עובי רקמת מינימלי שלהם.
עם זאת, הסתגלות של שיטות הסינון המבוססות על הדמיה למודלים של מחלה נוירולוגית ונוירו-התפתחותית של האדם פרצופים אתגר גדול. מפרקי הזמן הארוכים שבהם מערכת העצבים האנושית מתבשלה בvivo מחייבת הארכה של התרבות כדי להכיל תוכניות טבעיות של ביטוי גנים ולהשיג התבגרות עצבית.
אחת ההשלכות המעשיות של התוכנית הארוכה בידול עצבי הוא כי התחזוקה של תרבויות מונאולאייה הנגזרות חייב להיות מתמשך במשך שבועות רבים כדי להשיג בגרות סינפסה נאותה. בתקופה זו, הושלתי העצביים שנותרו מובחן ממשיכים להתחלק. אלה יכולים להגדיל במהירות את התרבות ולגזול את התוכן התזונתי הנדרש כדי לשמור על הנוירונים קיימא postmitotic. במרץ מחלק את התאים העצביים (NPCs) יכול גם להתחרות עם נוירונים עבור המצע הצמיחה. זה יכול להפוך את התרבויות כגון בעיות של הדבקה גרועה, מצב בלתי מתאים עבור הדמיה מבוססי assays אומר. יתר על כן, חוקרים רבים מוצאים כי נפח התרבות קטן יותר, הקושי לשמור על אוכלוסיות בריאות של נוירונים הבדיל מספיק זמן כדי להתבונן בשלבים המאוחרים של בידול עצבי. במילים אחרות, בחני התבגרות סינפסה באמצעות הקרנת תוכן גבוה (hcs) גישות יכול להיות מאוד מאתגר עבור נוירונים אנושיים נגזר.
כדי לעקוף כמה בעיות אלה, הליך של השעיית מחדש וציפוי מחדש שונות בעבר נוירונים הנגזרים הנגזרות השתמשו. ראשית, זה מאפשר את המחקר של neurite מוצלח (או, מדויק יותר, neurite התחדשות) באוכלוסייה של נוירונים מחויבים לחלוטין. שנית, את הציפוי של הנוירונים הבדיל בעבר מתבנית נפח גדול (כמו 10 לוחות ס”מ או גדול יותר), למטה לתבניות נפח קטן (כמו hcs תואם 96-או 384-ובכן מיקרוטיטר צלחות) מאפשר הפחתה משמעותית בזמן הכולל culturing ב המצב הקטן של אמצעי האחסון. זה מקל על המחקר של הרכבה סינפסה והתבגרות במשך השבועות הבאים בתוך מבחנה.
עם זאת, הציפוי של נוירונים בוגרים שכבר הקימו neurites ארוך ורשת קישוריות מורכבת מציג אתגרים מספר, אחד מהם הוא שיעור גבוה לפעמים משתנה של מוות תאים. כאן, אנו מתארים הליך מחדש שתוצאתו הישרדות תא מעולה והתוכסות. בדרך כלל, נוירונים חשופים אנזימים פרוטטרמין לתקופות דגירה קצר (בדרך כלל ~ 3-10 דקות) על מנת לנתק את התאים מן המצע לפני trituration. הזמן הקצר פרוטפוליזיס זה נוהג להשתמש עבור השעיית מחדש והפסמות סוגים רבים של תאים מפרידים, כולל תאים נוירוונונאליות מובחן ושלתי4,5,6. עם זאת, עבור נוירונים הבדיל הנושאת ארוך, neurites מחוברים, זה חיוני לא רק לנתק תאים מן המצע אלא גם לשבש את הרשת הדנדריטים ו סיבי כדי לבודד תאים בודדים תוך מזעור נזק. אכן, משעבוד עבה של נוירונים בדרך כלל נוטה להתנתק מהמצע כסדין אחד, ולא כתאים בודדים. אם הטיפול לא נלקח כדי לשחרר את הרשת עבה של neurites, נוירונים לא רק להיות ניזוק הפוך במהלך trituration, אבל רבים מהם לא לעבור דרך המסנן המשמש להסרת הגושים, וכתוצאה מכך התשואה התא המסכן. בהמשך אנו מתארים שינוי פשוט הליך הדגירה הנפוצה השימוש הפרוטאז לנגד הקשיים האלה.
בפרוטוקול המתואר להלן, הנוירונים מודבטים עבור 40-45 דקות עם פרוטאז קלה, כגון אנזים פרוטנוגד חרדה (למשל, Accutase). במהלך 5-10 הראשון מינימום לאחר הוספת האנזים, הרשת העצבית מרימה את המצע כגיליון. דגירה המשיכה הפרוטאז עבור 30-40 דקות נוספות לפני שתמשיך באמצעות נשחקו עדין וסינון. זמן דגירה נוסף זה מסייע להבטיח כי העיכול של החומר מרגיע את הרשת הבין-תאית, ובכך להבטיח כי הטריטורציה הבאה מייצרת השעיה של תאים בודדים. הליך זה מגדיל את אחידות התפלגות התאים בעת ציפוי מחדש תוך מזעור מוות התאים. החלתי בהצלחה את השיטה לציפוי מחדש לתרבויות הנוירואליות שנוצרו על ידי פרוטוקולי בידול שונים7,8 ומקווים שונים של hiPSCs. ההליך מתאים בעיקר לשימוש עם רוב או כל הקווים של תאי גזע נגזר הנגזרים. ראינו כי זמן דגירה מורחבת פרוטאז לא חיוני לחלוטין לציפוי תרבויות מלוחות בפורמט קטן (למשל, 35 מ”מ קוטר); עם זאת, כפי שאנו מראים כאן, הוא מספק יתרון משמעותי בעת ציפוי מחדש של צלחות בקוטר גדול (למשל, 10 ס”מ קוטר או גדול יותר), כנראה בגלל neurites בצלחות כאלה יכול להאריך תהליכים ארוכים מאוד וליצור מערך מחובר בצפיפות.
כאן אנו מדגימים שיטה זו ולהמחיש בקצרה את היישום שלה ב-asuritogenesis מוקדם ועבור התבגרות סינפסה, אשר כרוכה באשכולות של חלבונים טרום וסינפטית לאורך הדנדריטים ואקסונים, ואחריו מאוחר יותר לוקליזציה באתרי סינפטית. הדוגמאות מדגישות את היתרונות שפרוטוקול זה מציע בשימור הכדאיות של התאים והתוכסות. ראשית, היא מאפשרת לחוקרים ללמוד צעדים מוקדמים של האדם neuritogenesis. ההגדרה הניסיונית דומה התרבויות הראשיות בשימוש נפוץ של קליפת המוח מכרסם או נוירונים היפוקמאל, איפה התאים מופקים מאוחר או מוקדם לאחר לידה מוחית הלידה, התיר על ידי נשחקו לאחר טיפול פרוטאז עדין, ומותר ל ליזום neurites או להתחדש neurites שנותקו בהליך9,10. בדומה לנוירונים כאלה הראשי מכרסם, הנוירונים הנגזרים הנגזרות להתחיל טופס או לחדש neurites שלהם בתוך שעות לאחר הציפוי, המאפשר הדמיה של גביעי צמיחה ומורפולוגיה neurite בסביבה אופטימלית עבור הדמיה גבוהה זמן רקתית עם פחות תאים מובחן המקיפים. הבחנו כי neurite מוצלח מסונכרן יותר לעומת עיכובים משתנים שונים שיעורי מוצלח לראות כאשר הנוירונים הראשונים מתחילים להבדיל מאוכלוסיית הקדמון. בנוסף, ציפוי מחדש מאפשר בחני של נוירונים המבטא סמנים בעלי משנה עצביים בדרך כלל מופיעים בשלב מאוחר יותר בהתפתחות העצבית, כגון שכבת קליפת הביצה 5/6 שעתוק מקדם CTIP2 (עוף אובלבומין הזרם המקדם של שעתוק מיזם חלבון מקדם אינטראקציה 2), או הסמן הפאן-עצבי NeuN11. תכונה שימושית במיוחד של הגישה החוזרת היא כי synaptogenesis ההכנסות בתוך מסגרת זמן תואם HCS.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדגמנו הליך ישר קדימה עבור השעיה מחדש של התרבויות הנוירואליות האנושית הממוטב הכדאיות, בידול הצלחה, והדמיה subcellular באופן תואם פלטפורמות ההקרנה תוכן גבוה, ושאר הגורמים הרלוונטיים לגילוי הסמים. איור 6 ממחיש את זרימת העבודה הכוללת ודוגמאות ליישומים כאלה.
למרות ש…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היא מרכיב של קבוצות המחקר הלאומי הקואופרטיב תא שיתופיות (NCRCRG) ללמוד מחלות נפש נתמך על ידי NIH מענק U19MH1 2015-0644. העבודה הראשונית נתמכת גם על ידי NIH מענק NS070297. אנו מודים לד”ר קרול בלטו ופרד Gage, מכון סאלק, שסיפק את שורת ה-WT 126 של תאי הקדמון העצביים, ואת ד”ר יוג’ין יו ו לורנס גולדשטיין, UC בסן דייגו על מתן קו CVB WT24 של תאים מחולל קדמון עצבי. אנו מודים לדבורה Pre במעבדה של ד ר אן באנג, המכון לגילוי רפואי של סנפורד ברנהם, לדיונים שימושיים.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
Referências
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Langdon, S. P. . Cancer Cell Culture. , (2010).
- Picot, J. . Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
