Постдифференцирование Replating человека Плюрипотентные стволовые клетки полученных нейронов для высокого содержания скрининга неуритогенеза и синапсового созревания
Summary
Этот протокол описывает детальную процедуру для resuspending и culturing людские нейроны stem клетки выведенные которые ранее были продифференцированы от нервных прародителей in vitro на множественные недели. Процедура облегчает анализы нейритов, синапсов и поздневых нейронных маркеров на основе изображений в формате, совместимом со световой микроскопией и скринингом с высоким содержанием.
Abstract
Нейроны, отличаемые в двухмерной культуре от человеческих плюрипотентных стволовых клеток, полученных нейронными клетками-прародителями (NPC), представляют собой мощную модельную систему для изучения механизмов заболевания и проведения скрининга высокого содержания (HCS) для допроса соединения библиотек или определить фенотипы генных мутаций. Однако, с человеческими клетками переход от NPC к функциональному, возмужалым нейрону требует нескольких неделей. Синапсы обычно начинают формироваться после 3 недель дифференциации в монослойной культуре, и несколько нейронных белков, например, более поздний экспресс-нейрональный маркер NeuN, или слой 5/6 церереального коркового нейронного маркера CTIP2, начинают выражать около 4-5 недель после дифференциации. Это длительное время дифференциации может быть несовместимо с оптимальными условиями культуры, используемыми для небольших, многофункциональных платформ HCS. К числу многих проблем относятся потребность в хорошо совмещенной, равномерно распределенной ячейке с минимальной кластеризацией клеток и культурных процедурах, способствующих долгосрочной жизнеспособности и функциональному созреванию синапсов. Один из подходов заключается в дифференцировании нейронов в формате большого объема, а затем перенабчить их на более позднем этапе в HCS-совместимых мультискважин. Некоторые основные проблемы при использовании этого реплатингового подхода касаются воспроизводимости и жизнеспособности клеток из-за стрессовых нарушений дендритной и аксональной сети. Здесь мы демонстрируем детальную и надежную процедуру ферментативной перезагрузки антропогенных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) полученных нейронов после их дифференциации в течение 4-8 недель в крупнообъемном формате, передавая их 384-колодствующим микротитеру пластины, и культивирование их в течение еще 1-3 недель с отличным выживанием клеток. Это replating человеческих нейронов не только позволяет изучение синапса сборки и созревания в течение двух недель с момента повторного, но и позволяет исследования регенерации нейрита и роста конуса характеристики. Мы приведомляем примеры масштабируемых анализов на неуритогенез и синаптогенез с помощью платформы 384 колодца.
Introduction
Нейроны, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC), становятся все более актуальными в области фундаментальных исследований, разработки лекарственных средств и регенеративной медицины. Рабочие процессы и процедуры для оптимизации их культуры и обслуживания, а также повышения эффективности дифференциации в конкретные нейрональные подтипы, быстро развиваются1,2. Для повышения полезности и рентабельности нейронов, полученных из стволовых клеток человека, в качестве модельных систем, поддающихся анализу высокого содержания при обнаружении лекарственных средств и проверке целей, полезно уменьшить время культивирования, необходимое для создания зрелых, функциональных нейронов, сохраняя при этом максимальную прочность, воспроизводимость и релевантность фенотипа. Хотя трехмерные органоидные культуры являются движущей прорывв в исследовании нейроразвития3, 2-мерные монослойные культуры особенно совместимы с автоматизированными приложениями на основе изображений из-за их минимальной толщины тканей.
Однако адаптация методов скрининга на основе изображений к моделям неврологических и нейроразвития человека сталкивается с серьезной проблемой. Затяжные временные рамки, в течение которых нервная система человека созревает in vivo, требуют длительного времени в культуре для размещения естественных программ экспрессии генов и достижения нейронального созревания.
Одним из практических последствий длительной программы дифференциации нейронов является то, что поддержание hiPSC полученных монослойных культур должны быть устойчивыми в течение многих недель для достижения адекватной зрелости синапса. В течение этого времени, нейронные прародители, которые остаются недифференцированными продолжают делиться. Они могут быстро перерасти культуры и узурпировать содержание питательных веществ, необходимых для поддержания жизнеспособных постмитотических нейронов. Активно едить нервные клетки-прародители (NPC) также могут конкурировать с нейронами для роста субстрата. Это может сделать такие культуры подвержены проблемам плохой адгезии, состояние, неподходящее для анализов на основе изображений. Кроме того, многие исследователи считают, что чем меньше объем культуры, тем больше трудностей в поддержании здоровой популяции дифференцированных нейронов достаточно долго, чтобы наблюдать поздние стадии дифференциации нейронов. Другими словами, анализы созревания синапса с использованием подходов скрининга высокого содержания (HCS) могут быть очень сложными для нейронов, полученных человеком.
Чтобы обойти некоторые из этих проблем, была использована процедура повторного приостановки и повторного использования ранее дифференцированных нейронов, полученных от hiPSC. Во-первых, это позволяет изучать невритный рост (или, точнее, регенерацию неврита) в популяции полностью приверженных нейронов. Во-вторых, повторное переделывание ранее дифференцированных нейронов из большого формата громкости (например, 10 см пластин или больше), вплоть до небольших форматов громкости (например, HCS-совместимых 96- или 384-пузырчатого микротитерных пластин) позволяет значительно сократить общее время культивирования в небольшое состояние объема. Это облегчает изучение синапса сборки и созревания в течение последующих недель в пробирке.
Тем не менее, повторное переплетение зрелых нейронов, которые уже создали длинные невриты и сложную сеть подключения представляет собой несколько проблем, одна из которых иногда высокая и переменная скорость клеточной смерти. Здесь мы описываем процедуру повторного отреплирования, которая приводит к отличной выживаемости клеток и воспроизводимости. Как правило, нейроны подвергаются воздействию протеолитических ферментов в течение коротких инкубационных периодов (обычно 3-10 мин) для того, чтобы отделить клетки от субстрата до тритурации. Это краткое время протеолиза обычно используется для повторного приостановки и прохождения многих типов деления клеток, в том числе ненейрональных клеток и недифференцированных прародителей4,5,6. Однако для дифференцированных нейронов, несущих длинные, взаимосвязанные невриты, важно не только отделить клетки от субстрата, но и нарушить дендритную и аксональную сеть, чтобы изолировать отдельные клетки при минимизации повреждений. Действительно, толстая сетка нейронов обычно имеет тенденцию отделяться от субстрата как единый лист, а не как отдельные клетки. Если не принимать меры по ослаблению толстой сети нейритов, нейроны не только становятся необратимо поврежденными во время тритурации, но многие из них не проходят через фильтр, используемый для удаления комков, что приводит к плохой урожайности клеток. Ниже мы описываем простую модификацию широко используемой процедуры инкубации протеазы для борьбы с этими трудностями.
В описанном ниже протоколе нейроны инкубируются в течение 40-45 мин с легкой протеазой, например, протеолитическим ферментом (например, Accutase). В течение первых 5-10 минут после добавления фермента, нейронная сеть взлетает из субстрата в виде листа. Инкубация с протеаза продолжается еще 30-40 минут, прежде чем приступить к мягкой трикуляции и фильтрации. Это дополнительное время инкубации помогает гарантировать, что переваривание материала расслабляет межклеточной сети, тем самым гарантируя, что последующее тритурирование производит приостановление отдельных клеток. Эта процедура максимизирует единообразие распределения клеток при повторном окупаемости при минимизации клеточной смерти. Мы успешно применили этот метод повторного отправления к hiPSC полученных нейронных культур, порожденных различными протоколами дифференциации7,8 и из различных линий hiPSCs. Процедура номинально подходит для использования с большинством или всеми линиями стволовых клеток, полученных нейронов. Мы заметили, что продолжительное время инкубации протеазы не является абсолютно необходимым для перекалибровки культур из плит малого формата (например, диаметр 35 мм); однако, как мы показываем здесь, оно обеспечивает значительно преимущество от replating от плит большого диаметра (например, диаметр 10 сантиметров или большле), вероятно потому что neurites в таких плитах могут удлинить очень длинние процессы и сформировать плотно взаимосвязанный блок.
Здесь мы демонстрируем этот метод и кратко иллюстрируем его применение в анализах для раннего неуритогенеза и для созревания синапсов, который включает в себя кластеризацию до- и постсинаптических белков вдоль дендритов и аксонов, а затем их более поздние колокализация на синаптических сайтах. Примеры подчеркивают преимущества, которые дает этот протокол в сохранении жизнеспособности и воспроизводимости клеток. Во-первых, это позволяет следователям изучить ранние шаги в неуритогенез человека. Экспериментальная обстановка похожа на широко используемые первичные культуры корковых или гиппокампальных нейронов, где клетки извлекаются из позднего плода или раннего послеродового мозга, разобщены тритурой после мягкого лечения протеазы, и разрешено инициировать невриты или регенерировать невриты, которые были разорваны в процедуре9,10. Подобно таким первичным нейронам грызунов, нейроны, полученные из hiPSC, начинают формировать или регенерировать свои невриты в течение нескольких часов после повторного тестирования, что позволяет создавать конусы роста и морфологию нейритов в среде, оптимальной для высокой пространствентемпоральной визуализации с меньшим количеством окружающих недифференцированных клеток. Мы заметили, что неврит ный рост более синхронизирован по сравнению с переменной задержки и различные темпы роста видели, когда нейроны впервые начинают дифференцировать сяочку от популяции прародителей. Кроме того, переплатывание позволяет анализы нейронов, выражающих нейронные маркеры подтипа, которые обычно появляются позже в нервном развитии, такие как корковый слой 5/6 транскрипционный фактор CTIP2 (Куриный овальбумин вверх по течению промотор транскрипции взаимодействующий с фактором белок 2), или паннейрональный маркер NeuN11. Особенно полезной особенностью подхода replating является то, что синаптогенез протекает в сроки, совместимые с HCS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы продемонстрировали прямолинейную процедуру повторного и повторного обновления нейронных культур человека, которая оптимизирует жизнеспособность, успех дифференциации и субклеточную визуализацию таким образом, что она совместима с платформами скрининга с высоким содержанием, и ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа является составной частью Национальной кооперативной перепрограммированной группы по исследованию ячеек (NCRCRG) для изучения психических заболеваний и была поддержана грантом NIH U19MH1 2015-0644. Первоначальная работа также была поддержана грантом NIH NS070297. Мы благодарим доктора Кэрол Маркетто и Фред Гейдж, Институт Салка, за предоставление линии WT 126 нейронных клеток-прародителей, и доктора Евгений Ео и Лоуренс Гольдштейн, Калифорнийский университет в Сан-Диего за предоставление CVB WT24 линии нейронных клеток-прародителей. Мы благодарим Дебора Pre в лаборатории д-р Энн Банг, Сэнфорд Бернхэм Пребис медицинских открытий института, для полезных дискуссий.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
Referências
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Langdon, S. P. . Cancer Cell Culture. , (2010).
- Picot, J. . Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
