Summary
Nous présentons un assay de traction de haut débit fabriqué avec le caoutchouc de silicone (PDMS). Ce nouvel exemple est approprié pour étudier les changements physiques dans la contractilité cellulaire au cours de divers processus et maladies biologiques et biomédicaux. Nous démontrons l'utilité de cette méthode en mesurant une augmentation dépendante de TGF-MD de contractilité pendant la transition épithélial-à-mesenchymal.
Abstract
La contractilité cellulaire est essentielle dans divers aspects de la biologie, les processus de conduite qui vont de la motilité et la division, à la contraction des tissus et la stabilité mécanique, et représente un élément central de la vie animale multicellulaire. Dans les cellules adhérentes, la contraction de l'acto-myosine est observée dans les forces de traction que les cellules exercent sur leur substrat. La dysrégulation de la contractilité cellulaire apparaît dans une myriade de pathologies, faisant de la contractilité une cible prometteuse dans diverses approches diagnostiques utilisant la biophysique comme mesure. En outre, de nouvelles stratégies thérapeutiques peuvent être basées sur la correction du dysfonctionnement apparent de la contractilité cellulaire. Ces applications, cependant, nécessitent une quantification directe de ces forces.
Nous avons développé la microscopie à base d'élastomère de silicone (TFM) dans un format multi-puits parallallé. Notre utilisation d'un caoutchouc de silicone, en particulier le polydiméthylsiloxane (PDMS), plutôt que le polyacrylamide hydrogel couramment utilisé (PAA) nous permet de fabriquer des substrats robustes et inertes avec des durées de conservation indéfinies ne nécessitant pas de conditions de stockage spécialisées. Contrairement aux approches basées sur le pilier-PDMS qui ont un modulus dans la gamme GPa, le PDMS utilisé ici est très conforme, allant d'environ 0,4 kPa à 100 kPa. Nous créons une plate-forme à haut débit pour TFM en cloisonnant ces grands substrats monolithiques spatialement en puits biochimiques indépendants, créant une plate-forme multi-puits pour le criblage de force de traction qui est compatible avec les systèmes multi-puits existants.
Dans ce manuscrit, nous utilisons ce système de force de traction multi-puits pour examiner la transition épithéliale à mésenchymale (EMT); nous induisons l'EMT dans les cellules De MNO en les exposant au TGF-MD, et en quantifiant les changements biophysiques pendant l'EMT. Nous mesurons la contractilité en fonction de la concentration et de la durée de l'exposition au TGF-MD. Nos résultats ici démontrent l'utilité du TFM parallallé dans le contexte de la biophysique de maladie.
Introduction
La contractilité acto-myosine est un élément essentiel de la mécanique cellulaire active, ayant un impact sur les comportements cellulaires de la motilité et la prolifération à la différenciation des cellules souches. Dans les tissus, la contractilité entraîne l'activité de la séparation polaire dans l'embryogenèse, à la constriction des voies respiratoires et à l'activité cardiaque. De façon critique, pour générer de la tension, les cellules doivent d'abord adhérer à leur environnement extracellulaire. Ce faisant, cette contractilité génère des forces de traction sur leur environnement. La microscopie de traction force (TFM) a émergé sous une multitude de formes comme un moyen de quantifier ces forces à partir de cellules diverses dans des conditions différentes.
Le domaine de TFM a vu une ampleur exceptionnelle de l'innovation et de l'application, et les résultats ont ouvert la voie à de nouvelles perspectives en biologie, qui intègrent la mécanique et les forces physiques. En commençant par froisser les substrats de silicone1, les chercheurs ont appliqué diverses techniques pour mesurer les forces de traction cellulaire. Ces approches ont été continuellement améliorées et ont maintenant atteint un niveau de résolution de l'ordre de plusieurs microns2. Cependant, un problème principal est apparu, qui est la difficulté à créer des substrats de moduli convenablement faible en utilisant les silicones disponibles. Pour contourner ce problème, le polyacrylamide a été adopté comme un remplacement en raison de la facilité de créer des substrats de l'ordre de 1-20 kPa3. Nous avons récemment mis en œuvre des silicones très conformes dans TFM4, nous permettant de fabriquer la même gamme de moduli que le polyacrylamide, mais avec les avantages de silicone inerte et robuste.
Les approches DE la TFM ont permis de précieuses découvertes mécano-biologiques, cependant, une lacune persistante est leur complexité, limitant souvent leur utilisation aux chercheurs dans les disciplines de l'ingénierie ou des sciences physiques. Cela est dû en grande partie aux étalonnages détaillés et aux calculs difficiles qui sont nécessaires pour quantifier la contractilité. Un autre défi important est que les méthodes de TFM sont en grande partie à faible débit et donc mal adaptées pour étudier de nombreuses conditions ou populations différentes simultanément5. Cela a présenté un goulot d'étranglement, qui a entravé le transfert de TFM d'un établissement biophysique spécialisé dans des applications biologiques et pharmacologiques plus larges.
Nous avons récemment mis au point une plaque TFM multi-bien format, qui permet aux chercheurs de paralléliser leurs mesures TFM pour une quantification plus rapide des mesures de contractilité, tout en explorant l'impact de différents composés et en utilisant moins de réactifs4 . Cette méthodologie a une grande utilité dans diverses études de mécanobiologie, de l'évaluation des effets des composés sur l'activité cellulaire, à la quantification des changements contractuels dans la différenciation ou la maladie.
Un domaine de recherche biomédicale qui bénéficiera grandement de la TFM est l'étude de l'impact des indices physiques sur les phénotypes malins des cellules cancéreuses. La métastasie, responsable de 90% des décès liés au cancer, est caractérisée par des cellules cancéreuses quittant leur site tumoral d'origine et colonisant un site secondaire. Pour que les cellules migrent à travers les tissus et passent dans et hors du système vasculaire, elles doivent changer radicalement leurs formes pour se faufiler à travers ces barrières physiques tout en générant des forces substantielles pour tirer leur chemin le long de la matrice extracellulaire ou se déplacer entre les autres Cellules. Ces forces sont transmises au substrat par des interactions d'adhérence focale2,3, et peuvent être quantifiées à l'aide de TFM. Tandis que les cancers sont biochimiquement exceptionnellement divers, avec un répertoire croissant des mutations connues et des changements de protéine, quelques changements physiques communs ont été observés ; dans une variété de cancers, y compris les cancers du sein, de la prostate et du poumon, les cellules métastatiques ont été montrées pour exercer 2-3 fois les forces de traction des cellules non métastatiques6,7,8. Ces résultats suggèrent qu'il puisse y avoir une forte corrélation entre la progression métastatique et les forces de traction exercées par les cellules ; toutefois, il est difficile d'examiner les changements détaillés liés au temps dans la passéentité.
La transition épithéliale-à-mesenchymal (EMT) est un processus par lequel les cellules réduisent l'adhérence des cellules médiées par les adhérents et la jonction serrée, devenant plus migratrices et envahissantes. En plus des fonctions physiologiques qui incluent la cicatrisation des plaies et les processus de développement, l'EMT est également un processus exploité pendant la métastes, ce qui en fait un système modèle utile pour étudier ce processus. À l'aide de TGF-MD, nous pouvons induire l'EMT dans les cellules épithéliales mammaires maurines (NMuMG)9 pour quantifier directement les changements physiques au cours de cette transformation, et caractériser les effets dépendants du temps et de la dose de TGF-MD sur l'EMT et la contractilité cellulaire. Dans cet article, nous démontrons l'utilité de cette approche en mesurant les changements dans la contractilité pendant un EMT induit.
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Protocol
REMARQUE : Le protocole suivant guidera les chercheurs dans la fabrication et l'utilisation du plat TFM multi-puits présenté à la figure 1.
1. Préparation de substrats en silicone PDMS
- Préparation du mélange de caoutchouc de silicone PDMS basé sur un mélange composite de deux kits disponibles dans le commerce.
- Ajouter la partie A et la partie B du kit PDMS (p. ex., GEL-8100, voir la Table des Matériaux) dans un rapport de poids de 1:1 dans le tube de 50 ml.
REMARQUE : Le mélange est mélangé sur un rotateur à une vitesse assez lente pour que le mélange s'écoule d'avant en arrière pendant la révolution pour assurer un mélange complet. - Ajouter la quantité requise d'agent de durcissement pour le modulus désiré du substrat.
REMARQUE : La quantité d'agent de durcissement à ajouter au mélange dépend du modulus désiré du substrat et peut généralement varier de 0,1 % à 1,8 %. Consultez le tableau 1 et la figure 3 pour obtenir un guide sur les concentrations de liaisons croisées spécifiques et les moduli qui en résultent. - Mélanger la formulation sur le rotateur pendant 30-45 min; s'assurer que la rotation est assez lente pour un mélange approfondi.
- Ajouter la partie A et la partie B du kit PDMS (p. ex., GEL-8100, voir la Table des Matériaux) dans un rapport de poids de 1:1 dans le tube de 50 ml.
- Couche inférieure : revêtement des substrats PDMS sur la glissière de verre
- Placez le mandrin sur mesure illustré dans la figure 2 sur le spin-coater. Nettoyez le verre avec de l'éthanol ou de l'isopropanol et séchez-le avec une lingette sans matière de résineuse. Placez la glissière en verre dans le mandrin et allumez le vide pour maintenir la glissière en place.
- Appliquer le PDMS non durci à environ 1 cm des bords et travailler vers le centre. Appliquer suffisamment (3-4 mL) De PDMS pour s'assurer que toute la surface sera couverte.
REMARQUE : Pour s'assurer que le PDMS est uniformément réparti sur la surface du verre, une pointe de pipette peut être utile pour répandre le mélange de PDMS du centre aux bords. - Faites tourner le verre avec le mélange PDMS sur un spin-coater avec le protocole suivant.
- Pour étaler le PDMS non durci sur la glissière, accélérer à 50 tr/min/s de 0 à 200 tr/min; tenir à 200 tr/min pendant 1 min.
- Pour obtenir une couche PDMS de 100 m d'épaisseur, accélérez à 50 tr/min/s à 300 tr/min et maintenez 1 min à 300 tr/min. Différentes épaisseurs souhaitées autres que 100 m exigeront des valeurs de vitesse spécifiques.
- Pour enlever, décélérer à 50 tr/s à 0 tr/min. Désactiver l'aspirateur et retirer la glissière enduite, en prenant soin de ne pas toucher la surface enduite.
REMARQUE : Il est important d'inclure les étapes d'accélération et de décélération pour assurer une surface continue lisse.
CAUTION: Pour s'assurer que l'échantillon ne vole pas de la manne, le support sur mesure doit être utilisé pour tenir la diapositive, et ne pas compter simplement sur le vide et le mandrin plat existant. Les détails et les spécifications de ce titulaire sont donnés à la figure 2.
- Placer l'échantillon enrobé de spin dans le four à la température recommandée par le fabricant (100 oC) pendant 2 h.
REMARQUE : La surface du four où l'échantillon est placé doit être solide (c.-à-d. pas une grille) et la surface de niveau pour assurer le chauffage uniforme et l'épaisseur de l'échantillon. Une plaque en céramique ou en acier constitue une surface idéale.
- Couche supérieure de perle
- Ajouter la solution de perle dans le rapport approprié au mélange PDMS restant.
REMARQUE : Ce rapport dépend de la concentration de la solution de perle de stock et de la densité désirée de perle sur l'échantillon. Les valeurs finales typiques sont de 9,2 x 1011 perles/mL et de 0,05 à 0,2 perles/m2, et un excès de perles est généralement préférable à une quantité insuffisante. - Mélanger la solution de perles avec le PDMS non durci. Ceci peut être accompli en plaçant le tube sur un rotateur pendant approximativement 30 min, vortexing pendant 1-2 min, ou sonication pendant 30 min. Ces méthodes peuvent être combinées.
REMARQUE : Dans notre application, nous constatons que la sonication est efficace pour briser les agrégats de perles, et la rotation est efficace dans le mélange. Les perles fiduciaires synthétisées peuvent s'agréger dans le stockage. Avant d'être utilisés, ils peuvent être suspendus en hexane et sonicisés. S'il y a de gros agrégats importants, on peut filtrer la suspension de perle à l'intermédiaire d'un filtre à seringues de 5 m. Cette étape de filtration est facultative; il aide à enrober l'échantillon de perles monodispersées, mais une fraction importante des perles peut être perdue dans le filtre. - Sortir la lame du four, laisser refroidir à température ambiante et la placer sur le spin-coater.
- Ajouter 3-4 ml de perle et de mélange PDMS non durci sur la surface de l'échantillon enduit.
REMARQUE: Le mélange avec des perles ajoutées est moins visqueux en raison de l'hexane. Assurez-vous de ne pas toucher la surface du substrat car il peut endommager le substrat PDMS déjà recouvert. En outre, le mélange de perles peut initialement ne pas mouiller la surface; veillez à ce que le mélange ne s'écoule pas immédiatement de la surface guérie de PDMS. - Faites tourner l'échantillon avec le protocole suivant.
- Pour étendre le mélange de perles et de PDMS non durcis, accélérer à 100 tr/min/s de 0 à 500 tr/min; tenir à 500 tr/min pendant 1 min.
- Pour obtenir une mince couche de PDMS incorporé à la perle (1 m), accélérez à 200 tr/min/s de 500 à 5 000 tr/min; tenir à 5000 tr/min pour 10 s.
- Pour enlever, décélérer à 100 tr/min/s à 0 tr/min. Désactiver l'aspirateur et enlever la glissière enduite, en prenant soin de ne pas toucher la surface enduite.
- Placer l'échantillon enrobé de spin dans le four à 100 oC pendant 1 h.
REMARQUE : Des températures supérieures à 100 oC ou des durées supérieures à 1 h peuvent réduire la fluorescence des perles. Assurez-vous que la température du four est fixée à 100 oC et non supérieure. - Le protocole peut être mis en pause ici. Pour ranger l'échantillon, recouvrir la surface pour éviter l'exposition à la poussière et à la lumière. Assurez-vous que rien ne touche la surface. L'échantillon est stable à température ambiante indéfiniment.
- Ajouter la solution de perle dans le rapport approprié au mélange PDMS restant.
- Assemblage de la plaque
- Ajouter la partie A (base) et la partie B (agent de durcissement, p. ex. Sylgard) d'un kit d'élastomère PDMS dans un rapport de poids de 10:1 dans le tube de 50 ml.
- Mélanger le mélange sur le rotateur pendant 30-45 min.
REMARQUE : Pour une assiette, mélanger 5 ml de base avec 0,5 ml d'agent de durcissement. Jusqu'à 1 ml d'hexane peut être ajouté pour réduire la viscosité du mélange. - Appliquer le mélange au fond du diviseur et étendre le mélange.
REMARQUE : Le diviseur doit être placé à l'envers. - Déposer le substrat sur le diviseur à l'envers.
- Placer l'échantillon à l'envers dans le four à 65 oC pendant 2 h.
- Sortez les échantillons du four et nettoyez le fond du verre avec 70 % d'éthanol ou d'isopropanol pour éliminer tout résidu de PDMS.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Pour conserver l'échantillon, placez un couvercle sur le substrat et enveloppez l'appareil dans du papier d'aluminium pour éviter l'exposition à la lumière. L'échantillon est stable à température ambiante indéfiniment. Le diviseur utilisé dans cette méthode est dans un format de 96 puits; cependant, les chercheurs peuvent employer d'autres formats (384-bien, 2-bien, 4-bien, 8-bien, etc.) selon les configurations d'expérience souhaitées et la disponibilité des structures de division. Une autre optimisation peut être nécessaire.
2. Fonctionnalisation de surface
- Dissoudre 80 l d'un aliquot Sulfo-SANPAH dans 40 ml de tampon HEPES de 0,1 M (pH 7-9).
REMARQUE : Préparer les aliquots Sulfo-SANPAH en dissolvant 100 mg de poudre de Sulfo-SANPAH dans 2 mL de sulfoxide de diméthyle stérile (DMSO). Préparer 0,1 M de tampon HEPES en diluant 50 ml de HEPES dans 450 ml d'eau déionisée stérile et filtrer à travers un filtre à pores de 0,22 m. - Ajouter 200 l de solution Sulfo-SANPAH diluée à chaque puits de la plaque de 96 puits.
- Exposez la plaque à la lumière UV (300-460nm) à la distance et à la durée appropriées.
REMARQUE : Après l'exposition aux UV, la couleur de la solution doit être plus foncée. La distance et la durée de l'exposition aux UV dépendent de la puissance de la lampe UV. Dans notre application, nous exposons pendant 10-15 min à une distance de 5 cm. - Retirez la solution Sulfo-SANPAH des puits et ajoutez 200 l de 5 g/mL de fibronectin à chaque puits.
REMARQUE : Les protéines spécifiées par les chercheurs peuvent être utilisées pour le revêtement de surface. Certaines protéines couramment utilisées sont le collagène, la fibronectine et la lamininine. Nous avons trouvé Sulfo-SANPAH pour être la méthode la plus efficace, et le nettoyage du plasma tout en employant parfois dans PDMS est déconseillé car il crée une couche de dioxyde de silicium et endommage visiblement la surface. - Incuber la plaque à 4 oC pendant la nuit.
REMARQUE : Différentes méthodes d'incubation peuvent être appliquées en fonction de la protéine utilisée pour le revêtement. - Retirez la solution de fibronectine et lavez chaque puits avec de la saline tamponnée par le phosphate (PBS) deux fois.
- Placez un couvercle sur l'échantillon.
- Ajouter 200 L de PBS à chaque puits.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les échantillons enduits de fibronectine peuvent être conservés à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 2 semaines.
3. Stérilisation UV
- Stériliser l'échantillon sous la lumière UV dans une armoire de sécurité biologique pendant 30 min.
REMARQUE : Des temps d'exposition aux UV plus longs peuvent avoir un impact négatif sur la fluorescence des perles. Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées dans des conditions stériles.
4. Culture cellulaire
- Retirez le PBS de chaque puits et ajoutez 200 l de cellules suspendues dans les supports de culture à chaque puits.
- Plaquer les cellules à la densité cellulaire désirée. La densité cellulaire dépend de l'expérience souhaitée. Pour les études à cellule unique, les cellules doivent être distantes d'au moins 50 m et les cellules situées près des bords de la fenêtre d'imagerie ne devraient pas être incluses dans la mesure du TFM. Pour les cellules monocouches, la fenêtre d'imagerie devrait avoir le champ d'observation recouvert d'une couche de cellules confluentes.
- Préparer le média de culture de croissance complète pour les cellules NMuMG en complétant DMEM avec 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 'g/mL d'insuline, 1% pénicilline-streptomycine, 1 mM L-glutamine, et 0,5 'g/mL amphotericin B.
- Préparer le stock d'insuline en reconstituant dans de l'eau acidifiée (2,5 ml d'acide acétique glaciaire dans 130 ml d'eau déionisée) à une concentration de 10 mg/ml. Entreposer la solution de stock à 4 oC. Attendez que la solution soit claire, puis filtrez à travers un filtre à 0,22 m.
- Ajout de TGF-MD
- Pour préparer le stock de TGF-MD, dissoudre 2 g de TGF-M dans 100 'L d'acide citrique de 10 mM (pH 3,0) et filtrer la stérilisation avec 0,22 'm pores. Vortex le tube et aliquot dans les volumes désirés. Conserver les aliquots à -80 oC.
- Ajouter 1,5 L de solution de stock TGF-MD à 10 ml du support complet de la culture cellulaire pour constituer le support de culture cellulaire avec la concentration finale de TGF-MD de 3 ng/mL.
REMARQUE : Pour faire 10 mM de pH 3,0 acide citrique, diluer l'acide dans l'eau et ajuster le pH à 3,0 en ajoutant du HCl.
5. Acquisition de données
- Pour chaque position, acquérir au moins une image de particules fiduciaires et de cellules. Concentrez-vous sur la couche de perles.
REMARQUE : La taille des pixels doit être optimisée en fonction de la taille des particules fiduciaires et de la méthode de traitement d'image utilisée. Dans cette application, les auteurs utilisent un objectif 10x 0.4 NA, et les images sont acquises avec 1024 x 1024 résolution, avec 455 nm/pixel. En général, il est utile de conserver une résolution d'au moins 1-5 pixels par perle; ici, les perles sont polydisperse et ont une taille individuelle de 300-500 nm. Il est essentiel que les perles fiduciaires fluorescentes soient au point pour les images à utiliser pour les calculs TFM. La qualité de mise au point et d'imagerie des perles devrait être prioritaire par rapport à l'imagerie des cellules elles-mêmes. Il ne devrait pas y avoir de conversation croisée entre les différents canaux, en particulier toute fluorescence non des perles fiduciaires qui apparaît dans les spectres d'imagerie des perles. - Une fois que toutes les positions d'intérêt ont été enregistrées, ajoutez une solution de détachement à chaque puits pour acquérir des images de référence sans force des particules fiduciaires.
- Pour préparer la solution de détachement cellulaire, mélanger une solution aqueuse contenant 2 % de TritonX-100, 50 mM d'azide de sodium et 500 mM d'hydroxyde de potassium.
REMARQUE : Ce qui précède est fourni comme exemple d'une solution efficace de détachement. Différentes solutions de détachement à la discrétion des chercheurs peuvent être utilisées pour détacher les cellules de la surface du substrat.
- Pour préparer la solution de détachement cellulaire, mélanger une solution aqueuse contenant 2 % de TritonX-100, 50 mM d'azide de sodium et 500 mM d'hydroxyde de potassium.
6. Analyse d'image
- Effectuez l'analyse d'image appropriée comme désiré.
REMARQUE : Le logiciel d'analyse a été développé en interne. L'analyse d'image peut être faite avec des logiciels ou des logiciels sur mesure disponibles en ligne.
7. Synthèse de perles
REMARQUE : Le protocole suivant est basé sur la méthode de synthèse décrite par Klein et coll.10.
- Sous une hotte de fumée, préparer le flacon à trois cous à l'un condenseur de reflux refroidi à l'eau.
CAUTION : Configurez une synthèse dans une hotte chimique bien aérée. - Ajouter 0,5 ml de stabilisateur PDMS et de fluorophore au flacon.
- Équipez un cou d'un septum en caoutchouc d'une aiguille d'insee d'azote et d'une aiguille de sortie et équipez l'autre cou d'un septum en caoutchouc pour ajouter du réactif avec une seringue.
- Ajouter 100 ml d'hexane anhydre en 250 ml dans le flacon et ajouter une petite barre magnétique.
- Placer le flacon dans le bain d'huile minérale à 75 oC et le purger avec du gaz azoté pendant 1 h.
- Ajouter 6 ml de méthylmethacrylate à un flacon rond de 25 ml.
- Ajouter 0,100 g de 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) au flacon rond et purger le mélange avec du gaz azobisisobutyronitrile (AIBN) au flacon rond de fond et purger le mélange avec du gaz azosté pendant 1 h.
REMARQUE : Rincer le méthylamethacrylate à travers la colonne préemballée pour enlever les inhibiteurs avant utilisation. Ajouter le mélange de méthylamethacrylate et d'AIBN au flacon à trois cous. - La solution devient d'abord trouble et devient laiteuse. Laissez la réaction courir pendant 3 h après que la solution devienne trouble.
- Après 3 h, placer le flacon dans un bain d'eau glacée.
- Filtrer la solution à l'aspirateur avec du papier filtre grossier.
- Centrifuger la filtrate et re-suspendre les particules dans l'hexane.
REMARQUE : Le volume de l'hexane à ajouter dépend de la concentration souhaitée de la solution de perle. La sonication facilite la re-dispersion des particules de perles dans la solution hexane. Les perles produites par les auteurs ont des diamètres polydisperse d'environ 300-500nm. En raison de l'utilisation du suivi des modèles de corrélation croisée pour déterminer les déplacements, les perles monodisperse ne sont pas nécessaires.
8. Protocole de mesure de la rhéologie
REMARQUE : La rhéologie n'est pas nécessaire pour chaque chercheur ou expérience, mais est nécessaire pour quantifier le moduli pour de nouvelles formulations de PDMS. Dans ce protocole, nous employons un rhéomètre de cisaillement pour mesurer les effets du crosslinker, de la fréquence, et de la contrainte sur le moduli des échantillons de PDMS. Selon les outils et l'expertise disponibles, le moduli peut également être mesuré à l'aide de nombreuses autres approches d'analyse mécanique. De plus, les chercheurs qui utilisent ce protocole peuvent choisir d'utiliser notre moduli publié présenté au tableau1, à la figure 3 et à la figure 4.
- Utilisez un rhéomètre avec une géométrie de plaque parallèle de 25 mm de diamètre. D'autres géométries peuvent être utilisées.
- Initialiser le système et calibrer l'appareil et le système de mesure (plaque parallèle, d 25 mm). Après avoir mesuré l'écart zéro, commencez à charger l'échantillon de PDMS.
- Dès que l'élastomère PDMS et l'agent de liaison croisée ont été mélangés, le mélange de pipet sur la plaque inférieure du rhéomètre.
- Déplacez le fuseau vers le bas pour contacter complètement le haut de l'échantillon PDMS.
- Couper soigneusement l'excédent chargé de l'échantillon de la plaque inférieure.
- Lors d'un essai de balayage de la souche, appliquer des souches croissantes pour chaque composition avec une densité de liaison croisée différente pour s'assurer que la structure du polymère reste dans le régime viscoélastique linéaire pendant toutes les mesures de cisaillement.
REMARQUE : Les valeurs de la souche pertinentes pour les études cellulaires sont généralement de l'ordre de 0,1 à 10 %. Nous avons constaté que le SDPp était linéaire jusqu'à environ 100 % de souche. - Mesurez le modulus dynamique de stockage de cisaillement (G'), et le modulus de perte (G) du réseau DePMS dans un essai de balayage de temps avec la fréquence de 1 Hz et la contrainte oscillatoire de cisaillement de 0.5% à 100 oC.
- Pour déterminer la viscoélasticité et la dépendance temporelle du réseau PDMS final, appliquez un test de balayage de fréquence avec une fréquence allant de 0,1 à 100 Hz et une souche de cisaillement oscillatoire de 0,5 %.
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Representative Results
Avant l'ajout de TGF-MD, une monocouche confluente de cellules a une forme pavée de forme et est serrée. Lors du traitement TGF-MD, les cellules deviennent plus allongées en morphologie, agrandissant la zone cellulaire et acquérant un phénotype plus mésenchymal. Utilisant le dispositif multi-puits fabriqué avec des élastomères doux de PDMS, les propriétés physiques des cellules dans un total 17 conditions différentes ont été étudiées. Les cellules ont été traitées avec quatre concentrations différentes de TGF-MD (0,5, 1, 2 et 4 ng/mL) et quatre temps d'incubation différents (12, 24, 48, 96 h), et ces résultats sont résumés à la figure 5. Les cellules traitées avec TGF-MD appliquaient des contraintes de traction et des énergies de tension plus importantes que les cellules cultivées sans TGF-MD. Les cellules incubées avec du TGF-MD pendant 96 h présentaient les plus grandes contraintes de traction et les plus fortes énergies de contrainte. Les cellules ont appliqué de plus grandes contraintes et des énergies de contrainte une fois traitées avec une concentration plus élevée de TGF-MD. La différence entre les tractions et les énergies de contrainte était plus nette à des temps d'incubation plus longs.
La surface du substrat doit être lisse et uniformément recouverte de ligands, comme la fibronectine ou le collagène. Le revêtement rayé de surface et/ou non uniforme des ligands peut mener à l'attachement incorrect de cellules, ayant pour résultat la mesure inexacte de traction. La figure 6 montre les contraintes de traction localisées dues à la surface du substrat non uniforme.
Figure 1 : Aperçu de la fabrication de plaques multi-puits. (A) Un toboggan en verre taillé sur mesure est le point de départ. (B) La glissière en verre est recouverte d'une couche épaisse (100 m de PDMS). (C) Une couche de perles fiduciaires (en vert) sont ensuite recouvertes de spin dans une couche d'une épaisseur de 1 m au-dessus de la couche précédente. (D) Le diviseur multi-puits est soigneusement placé sur la couche de perles fiduciaires. (E) La plaque multi-puits complète est assemblée et prête à être utilisée ou entreposée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Mandrin personnalisé pour spin-coater. Pour empêcher le verre inférieur (où le PDMS est enduit) de s'envoler de la mandrin standard spin-coater, un support sur mesure est placé sur le mandrin. (A) Un support sur mesure pour le mandrin spin-coater. (B) Dessin d'ingénierie du support avec toutes les dimensions. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Rigidité du substrat avec changement de concentration de crosslinker (wt%). Les mélanges PDMS sont préparés comme décrit, avec le pourcentage de crosslinker supplémentaire augmentant le modulus élastique jusqu'à un maximum de 100 kPa à 1,8 pour cent de poids (wt%) crosslinker. Comme guide, le modulus en fonction de crosslinker est adapté linéairement, qui peut être utilisé par les chercheurs pour formuler leur propre mélange à un modulus souhaité particulier dans cette gamme. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Rhéologie de l'élastomère PDMS contenant 0, 0,15, 0,36 et 1 wt% d'agents à liaison croisée à une température de 100 oC. Les symboles triangle indiquent le modulus de perte (G'') et les symboles carrés indiquent le modulus de stockage (G'). (A) Balayage de temps oscillatoire à la fréquence de 1 Hz et souche de cisaillement de 0,5% pendant la gelation. (B) Balayage de fréquence oscillatoire du réseau PDMS à la souche de cisaillement de 0,5%. (C) Balayage de la souche du réseau PDMS à la fréquence de 1 Hz. Tous les points de données ont été acquis en triple. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Résultats représentatifs utilisant le dispositif de contrainte de traction avec le format multi-bien. Monolayer de cellules dans différentes conditions ont été cultivés dans un dispositif multi-puits pour mesurer la contractilité et l'énergie de contrainte. (A) Graphique des contraintes de traction avec l'augmentation du temps d'incubation du TGF-MD pour différentes concentrations de TGF-MD. Les contraintes de traction ont augmenté avec l'augmentation des concentrations de TGF-MD et du temps d'incubation. Toutes les données sont statistiquement significatives en ce qui concerne le contrôle (c.-à-d. pas de TGF-MD), sauf les suivantes : 12 h - 0,5 ng, 12 h - 1 ng, 48 h - 1 ng. (B) Graphique de l'énergie de la souche avec l'augmentation du temps d'incubation du TGF-MD pour différentes concentrations de TGF-MD. Les énergies de la souche ont augmenté avec l'augmentation des concentrations de TGF-MD et du temps d'incubation. La taille des échantillons varie de n à 7 à n et 15. Toutes les données sont statistiquement significatives en ce qui concerne le contrôle (c.-à-d., pas de TGF-) sauf les suivantes: 12 h - 0,5 ng, 12 h - 1 ng, 24 h - 0,5 ng, 24 h - 1 ng, 48 h - 1 ng. L'importance statistique a été déterminée à l'aide du test Kruskal Wallis, qui ne suppose pas une distribution normale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Résultats représentatifs d'une expérience sous-optimale (A, B) et d'une expérience satisfaisante (C, D). (A) Image de réflexion de la surface du substrat. Des contaminants indésirables, qui peuvent inclure de la poussière ou des fibres, ou des défauts matériels tels que des égratignures sont présents sur la surface du substrat. (B) Carte du stress de la contractilité cellulaire : en raison de la surface non uniforme, des contraintes de traction irrégulières et inexactes sont observées autour des objets. (C) Image de réflexion de la surface du substrat. Aucun contaminant apparent n'est visible. (D) Carte de stress de la contractilité cellulaire : aucune discontinuité d'artefact n'est visible. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Concentration de crosslinker (wt%) | G' (Pa) | Écart | E (kPa) | Écart |
| 0 (en) | 0,135 | 0,014 | 0,405 | 0,043 |
| 0,15 | 1 Fois | 0,1 | 3 (en) | 0,35 |
| 0,36 | 4,027 | 0,245 | à 12.081 | 0,73 |
| 0,75 | à 16h01 | 0,49 | 48,03 | 1,2 |
| 1 Fois | à 18 h 44 | 0,989 | 55,32 | 1,94 |
| 1,5 | 27,638 | 0,93 | 82,91 | 1,64 |
| 1,8 (en) | 33,986 | 0,88 | 101,94 | 1.088 Annonces |
| 2 (en) | 33,36 | 0,67 | 100,08 | 1.1 (en) |
Tableau 1 : Rigidité du substrat avec changement de concentration de crosslinker (wt%). En modifiant d'autres concentrations de liaisons croisées, les substrats PDMS du moduli de Young désiré sont fabriqués. Le moduli de cisaillement de PDMS ont été mesurés avec un rheomètre et le moduli de Young ont été déterminés. Pour chaque point de données, 3 préparations indépendantes ont été effectuées et l'écart type est donné.
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Discussion
Pour le succès de cette méthode, il est essentiel d'avoir un échantillon uniformément enduit d'une épaisseur constante d'environ 100 m. Le modulus doit être soigneusement choisi pour examiner la signification physique du système biologique d'intérêt. Lors de la fabrication d'une couche supérieure, la concentration des particules fluorescentes fiduciales doit être optimisée pour une analyse précise du déplacement et du stress de traction. L'analyse des cellules individuelles isolées nécessite une couche fiduciaire plus dense que la mesure des monocouches confluentes. En outre, la surface du substrat devrait avoir le revêtement stable et uniforme des molécules d'adhérence telles que le collagène, la fibronectine, et la lamininine pour assurer l'attachement approprié des cellules à la surface du substrat. Un soin particulier doit être pris lors de l'attachement du diviseur multi-puits; il doit être placé sans glisser pour empêcher la colle PDMS d'étanchéité d'être barbouillée sur la surface de la culture, et le bord extérieur doit être soigneusement aligné avec les dimensions de verre pour empêcher toute fuite sur les puits de bordure.
Pour éviter que les puits ne fuient, une quantité suffisante de colle PDMS doit être appliquée sur le diviseur de puits pour le maintenir en place. Cependant, l'utilisation de quantités excessives couvrira la surface de culture cellulaire.
Un volume suffisant de PDMS doit être ajouté au cours de la procédure de spin-coating. Lors du durcissement, le four et les grilles doivent être de niveau. Un PDMS inadéquat ou un four non nivelé peut entraîner une épaisseur inégale de PDMS.
La densité de perles doit être optimisée pour une analyse appropriée. Lorsque la densité de perles n'est pas adéquate, la concentration des perles dans le mélange fiduciaire de PDMS doit être augmentée. En outre, une quantité suffisante du mélange doit être ajouté pour le revêtement de spin. Pour assurer les signaux fluorescents appropriés des particules fiduciaires de perle, l'état de durcissement devrait être soigneusement surveillé. Des temps plus longs et des températures plus élevées que ceux spécifiés dans ce protocole peuvent dégrader la fluorescence. Un revêtement protéique inadéquat à la surface de l'échantillon peut entraîner une mauvaise adhérence cellulaire. Pour éviter cela, la surface doit être nettoyée et l'expiration des réactifs tels que Sulfo-SANPAH et ligands doit être vérifié. Le temps et la résistance de l'exposition aux UV doivent être optimisés. L'immunofluorescence ou d'autres protéines fluorescentes peuvent être testées pour assurer un revêtement uniforme en ligand.
L'appareil fabriqué avec cette méthode et l'ensemble de formulations PDMS ne s'applique qu'aux substrats avec le moduli de Young allant de 0,4 kPa à 100 kPa. D'autres moduli peuvent être possibles en utilisant des formulations alternatives, cependant, la gamme actuelle s'étend sur un large ensemble de valeurs physiologiquement pertinentes. Bien que cette méthode soit spécifiquement pour la fabrication multi-puits, elle peut également être utilisée pour préparer des diapositives individuelles ou d'autres géométries de diapositives, et dans ces cas d'autres dépannages utilisateur peuvent être nécessaires. Dans cette incarnation, une glissière en verre relativement épaisse (1 mm) est utilisée, empêchant les objectifs communs d'ouverture numérique élevée (NA) sur un microscope inversé. Bien qu'il soit techniquement possible de construire ces plats MULTI-bien TFM en utilisant du verre plus mince, la fragilité de ceux-ci dans le traitement et l'assemblage peut entraîner un taux élevé de rupture, et peut aller à l'encontre de l'approche à haut débit. En outre, le revêtement de surface peut être étudié plus avant pour des applications plus larges de l'appareil.
Utilisant un format multi-puits, des expériences à haut débit sont possibles. Le format multi-puits nous a permis d'examiner les changements physiques des cellules NMuMG pendant l'EMT avec le traitement TGF-MD avec des combinaisons de différentes concentrations et de différents temps d'incubation dans un seul plat. Fabrication de dispositifs de contrainte de traction avec des hydrogels tels que le gel de polyacrylamide ont plusieurs limitations. L'ingrédient dominant étant l'eau, les hydrogels sont sensibles aux concentrations de sel (osmolarité), à la température, à l'humidité et aux changements de pH. Les changements dans l'une de ces propriétés peuvent entraîner le changement des propriétés mécaniques du matériau, ce qui nécessite un soin supplémentaire dans l'utilisation d'échantillons et l'interprétation des résultats. En outre, ayant de l'eau, les hydrogels sont plus sensibles aux infections, nécessitant des soins supplémentaires. Contrairement aux hydrogels à base d'eau, le PDMS à base de silicone est stable et inerte. Une fois fabriqué, il peut être stocké à température ambiante indéfiniment sans nécessiter de conditions spéciales de manipulation ou de stockage.
La nature imperméable de PDMS nous permet de fabriquer un substrat monolithique, en veillant à ce que tous les puits sont vraiment identiques dans l'épaisseur et la composition du substrat, tout en permettant une biochimie unique à appliquer dans les médias, ou différentes cellules à utiliser dans chaque bien. Une surface à base d'hydrogel permet aux facteurs de diffusion de s'y pénétrer et de se déplacer, ce qui fait qu'il faut ajouter l'hydrogel à des puits qui sont autrement cloisonnés pour prévenir la contamination croisée.
Cette méthode permet aux chercheurs d'étudier la contractilité cellulaire, un aspect fondamental et omniprésent de la biologie cellulaire, d'une manière à haut débit, permettant l'acquisition de données plus efficaces et reproductibles. Cela aide à traduire la microscopie traction Force en criblage de force contractile, permettant aux chercheurs d'utiliser vraiment la contractilité comme mesure pour l'activité cellulaire, ou l'efficacité d'un composé. En tant que méthodologie, cela a de larges applications dans les sciences biophysiques et biomédicales, de la compréhension de la physique des cellules, à la caractérisation et à l'essai de composés pharmaceutiques par rapport à des types de cellules normalisées, ou peut-être très spécialisés cellules individuelles pour la médecine personnalisée.
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Disclosures
AJE et RK ont un intérêt dans Live Cell Technologies, une société qui fabrique des matériaux décrits dans cet article.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Tom Kodger, Michael Landry et Christopher J. Barrett de leur aide dans la synthèse des perles. A.J.E. reconnaît que le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie accorde des subventions RGPIN/05843-2014 et EQPEQ/472339-2015, la subvention des Instituts de recherche en santé du Canada no 143327, la subvention de la Société canadienne du cancer no 703930 et la Fondation canadienne pour l'innovation Projet #32749. R. Krishnan reconnaît la subvention no des National Institutes of Health. R21HL123522 et R01HL136209. H.Y. a reçu l'appui du Fonds de recherche Santé Québec et du Fonds de recherche Nature et Technologies Québec. Les auteurs remercient Johanan Idicula pour son aide avec la vidéo et le manuscrit et Zixin He pour l'aide dans la préparation de la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
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