Summary
אנו מציגים את התפוקה הגבוהה כוח המתיחה שיטת המציא עם גומי סיליקון (PDMS). העיבוד החדשני הזה מתאים ללימוד שינויים פיזיים בתהליך ביולוגי ומחלות בתהליכים ביולוגיים וביורפואיים שונים. אנו מדגימים את כלי השירות של שיטה זו על-ידי מדידת העליה התלויה של TGF-β במהלך המעבר האפיתל-למסמצ'אל.
Abstract
הקונקטיאליות הסלולרית חיונית בהיבטים מגוונים של ביולוגיה, תהליכי נהיגה הנעים מתנועתיות וחילוק, להתכווצות רקמות ויציבות מכנית, ומייצגת יסוד מרכזי בחיי החיות הסלולאריות. בתאים חסיד, acto-רירן התכווצות נתפסת כוחות המתיחה כי תאים להפעיל על מצע שלהם. דיסרגולציה של כמובן הסלולר מופיעה במגוון של פתוגיות, ובכך מהווה יעד מבטיח בגישות אבחון מגוונות המשתמשות בביופיזיקה כמדד. יתר על כן, אסטרטגיות טיפוליות הרומן יכול להיות מבוסס על תיקון התקלה לכאורה של הקונקטיציות לתא. יישומים אלה, עם זאת, דורשים כימות ישירה של כוחות אלה.
פיתחנו סיליקון אלסטורר מבוססי כוח המתיחה מיקרוסקופ (TFM) בפורמט רב מקביל מרובה היטב. השימוש שלנו בגומי סיליקון, במיוחד polydiמתיל siloxane (PDMS), במקום נפוץ הידרוג'ל polyאקרילאמיד (צפות) מאפשר לנו לעשות מצעים חזקים ומלא מוגבל עם חיי מדף מוגדר לא דורש תנאי אחסון מיוחדים. בניגוד לגישות המבוססות על עמוד-PDMS שיש להן מודולוס בטווח הממוצע, ה-PDMS המשמש כאן הוא תואם מאוד, החל מ-0.4 kPa עד 100 kPa. אנו יוצרים פלטפורמת תפוקה גבוהה עבור tfm על ידי חלוקה אלה מונוליטי מונוליטיים גדולים מרחב לתוך בארות עצמאיות ביולוגי, יצירת פלטפורמה מרובת היטב עבור הקרנה כוח המתיחה כי הוא תואם עם מערכות מרובות היטב קיים.
בכתב יד זה, אנו משתמשים זה מערכת כוח המתיחה רב היטב כדי לבחון את האפיתל כדי Mesenchymal מעבר (חובש); אנו לגרום לפרמדיק בתאי NMuMG על ידי חשיפת אותם TGF-β, ו לכמת את השינויים ביופיזיים במהלך החובשים. אנו מודדים את הקונקטיציה כפונקציה של ריכוז ומשך החשיפה של TGF-β. הממצאים שלנו כאן להפגין את התועלת של TFM מקבילים בהקשר של ביופיזיקה מחלה.
Introduction
Acto-רירן הקונקטיטיות היא מרכיב חיוני של מכניקת התא הפעיל, להשפיע על התנהגויות תא מתוך תנועתיות והתפשטות לבידול תא גזע. ברקמות, כונני כוננים מפני הפרדת הקוטב בembryogenesis, לכיוון הפרדה בדרכי הנשימה ולפעילות לב. באופן ביקורתי, כדי ליצור מתח, התאים חייבים תחילה לדבוק הסביבה החילוץ שלהם. בפעולה זו, הדבר יוצר כוחות המתיחה על סביבתם. כוח המתיחה מיקרוסקופית (TFM) התפתחה בהמון צורות כדרך לכמת את הכוחות הללו מתאים מגוונים בתנאים שונים.
תחום ה-TFM ראה רוחב יוצא דופן של חדשנות ויישום, והתוצאות סללו את הדרך לפרספקטיבות חדשות בביולוגיה, המשלבות מכניקה וכוחות פיזיים. החל עם קמטים מצעים סיליקון1, החוקרים החילו טכניקות שונות כדי למדוד כוחות המתיחה תא. גישות אלה השתפרו ברציפות והגיעו כעת לרמה של רזולוציה על סדר של כמה מיקרון2. עם זאת, בעיה עיקרית אחת התפתחה, וזה הקושי ביצירת מצעים של נמוך כראוי מודוללי באמצעות סיליקונים זמין. כדי לעקוף בעיה זו, פוליאקרילאמיד אומץ כתחליף בשל קלות יצירת מצעים על סדר 1-20 kPa3. לאחרונה הטמיעה סיליקונים תואמי מאוד ב-TFM4, מה שמאפשר לנו להמציא את אותו מגוון של מודלי כמו פוליאקרילאמיד, אבל עם היתרונות של הסיליקון האינרטי והחזק.
גישות TFM אפשרו לתגליות מכנייות יקרות ערך, עם זאת, קיצור מתמשך הוא המורכבות שלהם, לעתים קרובות הגבלת השימוש שלהם לחוקרים בתחומי ההנדסה או המדעים הפיזיים. הדבר נובע בחלקו הגדול לחישובים הכיול והמאתגרים המפורטים הנדרשים לכמת. אתגר משמעותי נוסף הוא כי שיטות TFM הן במידה רבה תפוקה נמוכה ולכן מתאים ללמוד מצבים שונים או אוכלוסיות רבות בו5. זה הציג צוואר בקבוק, אשר העביר העברה של TFM מתוך הגדרת ביופיזיקה מומחה ליישומים ביולוגיים ותרופתי רחב יותר.
פיתחנו לאחרונה לוחית מרובת בפורמט TFM, אשר מאפשר לחוקרים למקביל מדידות TFM שלהם עבור כימות מהיר יותר של מדדי הקונקטיזציה, תוך חקירת ההשפעה של תרכובות שונות גם באמצעות פחות ריאגנטים4 . מתודולוגיה זו כוללת כלי שירות רחב במחקרים שונים של המכונה, מהערכת ההשפעות של תרכובות בפעילות הסלולר, כדי לכמת את השינויים הקונקטילה בידול או מחלה.
תחום אחד של מחקר ביו שיועיל מאוד מ TFM הוא המחקר של איך רמזים פיזיים השפעה על פנוטיפים ממאירים של תאים סרטניים. גרורה, אחראי 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן, מאופיין על ידי תאים סרטניים עוזב את אתר הגידול המקורי שלהם מטביל אתר משני. עבור תאים לעבור דרך הרקמה ולעבור פנימה והחוצה של מערכת כלי הדם, הם חייבים באופן קיצוני לשנות את הצורות שלהם כדי לסחוט את המחסומים הפיזיים האלה תוך יצירת כוחות משמעותיים כדי למשוך את דרכם לאורך מטריקס מסחטות או לנוע בין השני תאים. כוחות אלה מועברים למצע דרך אינטראקציות הדבקה מוקד2,3, וניתן לכמת באמצעות tfm. בעוד סרטן הם ביוכימית מגוונת במיוחד, עם רפרטואר המתרחב של מוטציות ידועות שינויי חלבון, כמה שינויים פיזיים נפוצים נצפו; במגוון של סרטן, כולל שד, ערמונית, סרטן הריאות, תאים גרורתי הוכחו להפעיל 2-3 פעמים כוחות המתיחה של תאים לא גרורתי6,7,8. תוצאות אלה מרמזות כי ייתכן שיש קורלציה חזקה בין התקדמות גרורתית וכוחות המתיחה המופעל על ידי תאים; עם זאת, קשה לבחון את השינויים תלויי הזמן המפורטים במהלך הבחינה.
המעבר האפיתל-ל-mesenchymal (חובש) הוא תהליך לפיו התאים להפחית חסיד והדוק הצומת מתווך התא תא הדבקה, להיות נדידה יותר פולשנית. בנוסף לפונקציות פיזיולוגיות הכוללות ריפוי בפצע ותהליכים התפתחותיים, הצוות החובש הוא גם תהליך מנוצל במהלך גרורות, מה שהופך אותו מערכת מודל שימושי כדי ללמוד את התהליך הזה. באמצעות TGF-β, אנחנו יכולים לגרום לחובש בתאי האפיתל של הפטמות של מורי (NMuMG)9 כדי לכמת ישירות את השינויים הפיזיים במהלך שינוי זה, ולאפיין את הזמן ואת ההשפעות התלויות במינון של tgf-β על החובשים וכלי הסלולר. במאמר זה, אנו מדגימים את כלי השירות של גישה זו על-ידי מדידת השינויים בתהליך הפעולה המושרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול הבא ידריך את החוקרים בבדיית ושימוש בצלחת TFM multi-היטב המוצגת באיור 1.
1. הכנת מצעים סיליקון מסדרת PDMS
- הכנת תערובת גומי של הסיליקון PDMS מבוסס על תערובת מורכבת של שני ערכות זמינות מסחרית.
- הוסף חלק A וחלק B של ערכת PDMS (g., ג'ל-8100, ראה את הטבלה של חומרים) ביחס משקל 1:1 לתוך שפופרת ה50 mL.
הערה: התערובת מעורבת על מסובבי במהירות איטית מספיק כדי שהתערובת תזרום הלוך ושוב במהלך המהפכה כדי להבטיח ערבוב מלא. - להוסיף את הכמות הנדרשת של ריפוי סוכן עבור מודולוס הרצוי של המצע.
הערה: כמות סוכן הריפוי שיש להוסיף לתערובת תלויה במודולוס הרצוי של המצע והוא עשוי לרוב לנוע בין 0.1% ל 1.8%. עיין בטבלה 1 ובאיור 3 עבור מדריך לריכוזי מקשר מסוימים וכתוצאה מכך מודלי. - לערבב את הניסוח על הסובב עבור 30-45 דקות; להבטיח את הסיבוב הוא איטי מספיק כדי ערבוב יסודי.
- הוסף חלק A וחלק B של ערכת PDMS (g., ג'ל-8100, ראה את הטבלה של חומרים) ביחס משקל 1:1 לתוך שפופרת ה50 mL.
- השכבה התחתונה: ציפוי מצעים PDMS על שקופית זכוכית
- הציבו את הצ שנבנה בהתאמה אישית באיור 2 על הספין-קואטר. נקו את הזכוכית בעזרת אתנול או איזופנול, והתייבשו במחיקה ללא מוך. מניחים את שקופית הזכוכית של צ'אק ולהדליק את הוואקום כדי להחזיק את השקופית במקומה.
- החלת PDMS לא נרפא כ 1 ס מ מן הקצוות ולעבוד לקראת המרכז. החל מספיק (3-4 mL) PDMS כדי להבטיח את פני השטח כולו יהיה מכוסה.
הערה: כדי לוודא ש-PDMS מתפשט באופן שווה על פני הזכוכית, מומלץ לפזר את התערובת של PDMS מהמרכז ועד לקצוות. - סובב את הזכוכית עם התערובת PDMS על מסתובב ספין עם הפרוטוקול הבא.
- כדי להפיץ את PDMS לא נרפא בשקופית, להאיץ ב 50 rpm/s מ 0 כדי 200 rpm; להחזיק ב 200 rpm עבור 1 דקות.
- כדי להשיג 100 יקרומטר עבה pdms שכבה, להאיץ ב 50 rpm/s כדי 300 rpm ולהחזיק עבור 1 דקות ב 300 rpm. בעוביים שונים הרצויים מלבד 100 יקרומטר ידרשו ערכי מהירות ספציפיים.
- כדי להסיר, להאט את 50 rpm/s כדי 0 סל ד. בטל ואקום ולהסיר את השקופית מצופה, מטפל לא לגעת משטח מצופה.
הערה: חשוב לכלול את ההאצה ואת צעדי ההאטה כדי להבטיח משטח רציף חלק.
התראה: כדי לוודא שהדוגמה אינה מטיסה את ה-צ'אק, יש להשתמש במחזיק המותאם אישית כדי להחזיק את השקופית, ולא להסתמך פשוט על הוואקום ועל הצ השטוח הקיים. הפרטים והמפרטים של בעל זה ניתנים באיור 2.
- מניחים את המדגם מצופה הספין בתנור בטמפרטורה מומלצת ליצרן (100 ° c) עבור 2 h.
הערה: המשטח של התנור שבו המדגם ממוקם צריך להיות מוצק (כלומר, לא מתלה תיל) ומשטח רמה כדי להבטיח חימום אחיד ועובי של המדגם. לוחית קרמיקה או פלדה מייצרת משטח אידיאלי.
- שכבת חרוזים למעלה
- הוסף פתרון חרוז ביחס המתאים לתערובת PDMS הנותרת.
הערה: יחס זה תלוי בריכוז של הפתרון חרוז מניות ואת צפיפות חרוז הרצוי על המדגם. ערכים סופיים טיפוסיים הם 9.2 x 10 חרוזים/mL ו 0.05-0.2 חרוזים/μm2, ו עודף של חרוזים הוא בדרך כלל עדיף על סכום מספיק. - לערבב את הפתרון חרוז עם PDMS שלא נרפא. זה עשוי להתבצע על ידי הצבת צינור על מסובבי במשך כ 30 דקות, vortexing עבור 1-2 דקות, או sonication עבור 30 דקות. שיטות אלה עשויות להיות משולבות.
הערה: ביישום שלנו, אנו מוצאים כי sonication יעיל בשבירת אגרגטים חרוז, וסיבוב יעיל ערבוב. חרוזים מסונתז יכולות לצבור באחסון. לפני השימוש, הם עשויים להיות מושעה מחדש הקסאן ו sonicated. אם יש אגרגטים גדולים משמעותיים, אחד יכול לסנן את השעיית חרוז דרך מסנן מזרק 5 יקרומטר. שלב סינון זה הוא אופציונלי; זה עוזר לחלוק את המדגם עם חרוזים מונוטוני, אבל חלק משמעותי של חרוזים עלול לאבד את הפילטר. - מניחים את השקופית מהתנור, מאפשרים לצנן את טמפרטורת החדר ולהניח אותה על הספין-מאטר.
- הוסף 3-4 mL של התערובת ובלתי נרפא PDMS על פני השטח של המדגם מצופה.
הערה: התערובת עם חרוזים הוסיף היא צמיג פחות בשל ההקאן. ודא שלא לגעת במשטח של המצע כפי שהוא עלול לגרום נזק המצע מצופה PDMS. בנוסף, תערובת חרוז עשוי בתחילה לא להרטיב את פני השטח; לדאוג כי התערובת לא לזרום מיד את המשטח PDMS נרפא. - סובב את הדגימה. עם הפרוטוקול הבא
- כדי להפיץ את התערובת וללא נרפא PDMS, להאיץ ב 100 rpm/s מ 0 כדי 500 rpm; להחזיק ב 500 rpm עבור 1 דקות.
- כדי להשיג שכבה דקה של חרוז מוטבע PDMS (~ 1 μm), להאיץ ב 200 rpm/s מ 500 כדי 5000 rpm; להחזיק ב 5000 rpm עבור 10 s.
- כדי להסיר, להאט את 100 rpm/s כדי 0 סל ד. להשבית ואקום ולהסיר שקופית מצופה, מטפל לא לגעת משטח מצופה.
- מניחים את המדגם מצופה הספין בתנור ב 100 ° c עבור 1 h.
הערה: טמפרטורות מעל 100 ° צ' או משכים יותר מ 1 h יכולים להפחית את הזריחה חרוז. ודאו שטמפרטורת התנור מוגדרת ל-100 ° c ואינה גבוהה יותר. - הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. כדי לאחסן את המדגם, לכסות את פני השטח כדי למנוע חשיפה לאבק ואור. ודא ששום דבר לא נוגע בפני השטח. המדגם הוא יציב מדף בטמפרטורת החדר לנצח.
- הוסף פתרון חרוז ביחס המתאים לתערובת PDMS הנותרת.
- הרכבת צלחת
- הוסף חלק א (בסיס) וחלק ב' (סוכן מרפא, לדוגמה, Sylgard) של ערכת אלסטומר PDMS ביחס משקל 10:1 לתוך צינור השפופרת 50 mL.
- מערבבים את התערובת על הסובב עבור 30-45 דקות.
הערה: עבור צלחת אחת, לערבב 5 מ ל בסיס עם 0.5 mL של ריפוי סוכן. עד 1 מ ל של הקסאן ניתן להוסיף כדי להקטין את צמיגות של התערובת. - החילו את התערובת על תחתית המחיצה והפיצו את התערובת.
הערה: יש להציב את המפריד הפוך. - הנח את המצע על המפריד הפוך.
- מניחים את המדגם הפוך בתנור ב 65 ° c עבור 2 h.
- קחו דגימות מהתנור ונקו את החלק התחתון של הזכוכית עם 70% אתנול או איזופנול כדי להסיר שאריות PDMS.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. כדי לאחסן את המדגם, המקום מכסה על מצע ולעטוף את המכשיר רדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. המדגם הוא יציב מדף בטמפרטורת החדר לנצח. המפריד שנוצל בשיטה זו הוא בפורמט 96-והיטב; עם זאת, החוקרים עשויים להעסיק פורמטים אחרים (384-ובכן, 2-ובכן, 4-טוב, 8-ובכן, וכו ') בהתאם הגדרות הניסוי הרצוי וזמינות של חלוקת מבנים. ייתכן שיהיה צורך במיטוב נוסף.
2. פונקציונליזציה של פני השטח
- התמוססות 80 μL של Sulfo-SANPAH תוך 40 מ ל של 0.1 M HEPES מאגר (pH 7-9).
הערה: הכינו את Sulfo-sanpah אמצעות המסת 100 mg של אבקת Sulfo-SANPAH 2 מ ל של דימתיל סטרילי סולפוקסיד (DMSO). הכינו 0.1 M hepes מאגר על ידי דילול 50 mL של hepes ב 450 מ ל של מים מעוקרים סטרילי ולסנן דרך מסנן הנקבוביות ה0.22 יקרומטר. - הוסף 200 μL של פתרון Sulfo-SANPAH מדולל כל טוב של הצלחת 96-באר.
- לחשוף את הצלחת כדי UV (300-460nm) אור במרחק המתאים ומשך.
הערה: לאחר חשיפה UV, הצבע של הפתרון צריך להיות כהה יותר. מרחק חשיפה UV ומשך תלוי בכוח המנורה UV. באפליקציה שלנו, אנו חושפים עבור 10-15 דקות במרחק של 5 ס"מ. - הסר את הפתרון Sulfo-SANPAH מבארות ולהוסיף 200 μL של 5 μg/mL fibronectin פתרון לכל טוב.
הערה: לציפוי פני השטח ניתן להשתמש בחלבון שצוין לחוקר. כמה חלבונים בשימוש נפוץ הם קולגן, fibronectin, ו למינציה. יש לנו מצאנו Sulfo-SANPAH להיות השיטה היעילה ביותר, וניקוי פלזמה בעוד לפעמים העסקת PDMS הוא מיואש כפי שהוא יוצר שכבת סיליקון דו חמצני בעליל נזקים המשטח. - מודקת את הצלחת ב 4 ° c בלילה.
הערה: ניתן להחיל שיטות דגירה שונות בהתאם לחלבון המשמש לציפוי. - הסר את הפתרון fibronectin ולשטוף כל טוב עם מלוחים מואגור פוספט (PBS) פעמיים.
- . שים מכסה על הדגימה
- הוסף 200 μL של PBS לכל טוב.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן את הדגימות מציפוי fibronectin ב-4 ° צ' עד 2 שבועות.
3. העיקור של קרינת UV
- לחטא את המדגם תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגי עבור 30 דקות.
הערה: עוד פעמים חשיפה UV עשוי להשפיע לרעה על הזריחה חרוז. יש לבצע את כל הפעולות הבאות בתנאים סטריליים.
4. תרבית תאים
- להסיר PBS מכל באר ולהוסיף 200 μL של תאים הושעו במדיית התרבות לכל טוב.
- לוחית את התאים בצפיפות התא הרצויה. צפיפות התא תלויה בניסוי הרצוי. עבור לימודי תא בודד, על התאים להיות מינימלי של 50 יקרומטר בנפרד ותאים הקרובים לקצות חלון ההדמיה לא ייכללו במדידה tfm. עבור תאים מונאולייר, חלון ההדמיה צריך להיות שדה הצפייה מכוסה בשכבה שוטפת של תאים.
- הכינו את מדיית תרבות הצמיחה המלאה עבור תאים NMuMG על ידי השלמת DMEM עם 5% FBS, 10 מ"מ HEPES, 10 μg/mL אינסולין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1 מ"מ L-גלוטמין, ו 0.5 μg/mL אמפוריטיצין B.
- הכנת מלאי אינסולין על ידי מחדש במים acidified (2.5 mL של חומצה אצטית קרחוני ב 130 מ ל של מים מומלים) לריכוז של 10 מ"ג/mL. אחסן את פתרון המניה ב-4 ° c. המתן עד שהפתרון יהיה ברור ולאחר מכן סנן דרך מסנן נקבובית של 0.22 יקרומטר.
- TGF-β הוספה
- כדי להכין את מלאי tgf-β, התמוססות 2 μg של tgf-β ב-100 μl של חומצה לימון של 10 מ"מ (pH 3.0) ומסנן לעקר עם הנקבוביות 0.22 יקרומטר. מערבולת הצינור ו-סדרת מחלקים לתוך הכרכים הרצויים. אחסן את הליאביטים ב-80 ° c.
- הוסף 1.5 μL של TGF-β פתרון מניות ל 10 מ ל של מדיה התרבות התא השלם להוות את התקשורת התרבות התא עם הריכוז TGF-β האחרון של 3 ng/mL.
הערה: כדי להפוך 10 מ"מ pH 3.0 לימון חומצה, לדלל את החומצה במים ולהתאים את ה-pH כדי 3.0 על ידי הוספת HCl.
5. רכישת נתונים
- עבור כל תנוחה, לרכוש תמונה אחת לפחות של חלקיקים ותאים הנאמנות. התמקד בשכבת חרוז.
הערה: גודל הפיקסל צריך להיות ממוטב בהתבסס על גודל חלקיקי הנאמנות ושיטת עיבוד התמונה בשימוש. ביישום זה, המחברים להשתמש במטרה 10x 0.4 NA, ותמונות נרכשים עם 1024 x 1024 רזולוציה, עם 455 nm/פיקסל. באופן כללי, זה מועיל לשמור על רזולוציה של לפחות כ 1-5 פיקסלים לכל חרוז; כאן, חרוזים הם פוליהתפזר ויש להם גודל בודד של 300-500 ננומטר. חשוב לעשות שימוש בחרוזים של מרכז הפלורסצנט במיקוד של תמונות שישמשו לחישובי TFM. המיקוד ואיכות ההדמיה של החרוזים צריכים להיות בעדיפות גבוהה יותר על הדמיה של התאים עצמם. לא צריך להיות שיחה צולבת בין ערוצים שונים, במיוחד כל זריחה לא מחרוזים הנאמנות אשר מופיע ספקטרום ההדמיה של החרוזים. - ברגע שכל המיקומים המעניינים נרשמו, הוסף פתרון התנתקות לכל באר כדי לרכוש תמונות התייחסות ללא כוח של חלקיקי הנאמנות.
- כדי להכין את פתרון התנתקות התא, לערבב פתרון מימית המכיל 2% TritonX-100, 50 mM הנתרן azide, ו 500 מילימטר אשלגן הידרוקסיד.
הערה: התמונה לעיל מסופקת כדוגמה לפתרון התנתקות אפקטיבי. פתרונות ניתוק שונים בשיקול הדעת של החוקרים עשויים לשמש לניתוק התאים ממשטח המצע.
- כדי להכין את פתרון התנתקות התא, לערבב פתרון מימית המכיל 2% TritonX-100, 50 mM הנתרן azide, ו 500 מילימטר אשלגן הידרוקסיד.
6. ניתוח תמונה
- בצע ניתוח תמונה מתאים כרצונך.
הערה: תוכנת ניתוח פותחה בתוך הבית. ניתן לבצע ניתוח תמונה בתוכנות או בתוכנות מותאמות אישית הזמינות באינטרנט.
7. חרוז לסינתזה
הערה: הפרוטוקול הבא מבוסס על שיטת הסינתזה המתוארת על ידי קליין ואח '10.
- מתחת למכסה המנוע, הכינו את הבקבוקון התלת-צווארי עם הקבל ריפלוקס מקורר מים.
התראה: הגדרת סינתזה במיזוג כימי מאוורר היטב. - הוסף 0.5 mL של מייצב PDMS ו fluorophore אל הבקבוקון.
- לצייד צוואר אחד עם מחיצת גומי עם מחט מפרץ חנקן ומחט לשקע ולצייד את הצוואר השני עם מחיצת גומי להוסיף הכימית עם מזרק.
- הוסף 100 mL של הקסאן בשנת 250 mL לבקבוקון ולהוסיף בר מגנטי קטן.
- מניחים את הבקבוקון באמבט השמן המינרלים ב-75 ° c ומטהר אותו בעזרת גז חנקן במשך 1 שעות.
- הוסף 6 מ ל של מתיל מתילאקריל 25 מ"ל בקבוקון התחתון עגול.
- להוסיף 0.100 g של 2, 2 '-אזוביוביוזוטריל (AIBN) לתוך הבקבוקון התחתון עגול ולטהר את התערובת עם גז חנקן עבור 1 h.
הערה: הסרת מעכבי לפני השימוש בטור מראש. הוסף תערובת של מתילאמאטיאקריל. ובקבוק שלוש הצוואר - הפתרון בתחילה הופך מעונן והופך חלבי. תן את התגובה לרוץ 3 h לאחר הפתרון הופך מעונן.
- לאחר 3 שעות, מניחים את הבקבוקון באמבט מים בקרח.
- ואקום-לסנן את הפתרון עם נייר סינון גס.
- צנטריפוגה את הפילטרט ולהשעות מחדש את החלקיקים הקסאן.
הערה: נפח ההקאן שיש להוסיף תלוי בריכוז הרצוי של פתרון החרוז. Sonication מקלה פיזור מחדש של חלקיקי חרוז בתמיסה הקסאן. חרוזים המיוצרים על ידי המחברים יש לפזר קטרים של כ 300-500nm. בשל השימוש במעקב אחר מיתאם דפוס כדי לקבוע displacements, חרוזים חד מונוסון אינם נדרשים.
8. מדידה לפרוטוקול ראולוגיה
הערה: Rheology אינו נדרש עבור כל חוקר או ניסוי, אבל הוא הכרחי כדי לכמת את המודוללי עבור ניסוחים חדשים של PDMS. בפרוטוקול זה, אנו מעסיקים מדידת הטיה כדי למדוד את ההשפעות של מקשר, תדר, ולהתאמץ על מודלי של דגימות PDMS. בהתאם לכלים ולמומחיות הזמינים, ניתן למדוד את מודולים גם באמצעות גישות רבות אחרות של ניתוח מכני. בנוסף, החוקרים באמצעות פרוטוקול זה עשויים לבחור להשתמש שלנו שפורסמו מודלי הציג בטבלה 1, איור 3 ואיור 4.
- השתמש במטר עם קוטר של 25 מ"מ מקביל לצלחת מקבילית. ניתן להשתמש בגאומטריות אחרות.
- אתחל את המערכת וכיול את מערכת ההתקן והמדידה (הלוח המקביל, d = 25 מ"מ). לאחר מדידת פער האפס, התחל לטעון את דגימת PDMS.
- ברגע אלסטואר PDMS ו-crosslinking קישור מעורבים, ללטף את התערובת על הצלחת התחתונה של rheometer.
- הזז את הציר כלפי מטה כדי ליצור קשר עם החלק העליון של דגימת PDMS.
- לקצץ בזהירות את מדגם שנטען עודף מלוחית התחתונה.
- בבדיקה לטאטא זן, להחיל זנים הגדלת עבור כל קומפוזיציה עם צפיפות שונה הקישור החוצה כדי להבטיח את שרידי מבנה פולימרי במשטר גמיש ליניארי אלסטי במהלך כל מדידות להטות.
הערה: ערכי הזנים הרלוונטיים ללימודי תא הם בדרך כלל בטווח של 0.1-10%. מצאנו PDMS להיות ליניארי עד כ 100% המתח. - מדוד את מודול האחסון הדינאמי להטות (G), ומודולוס הפסד (G ' ′) של רשת PDMS בזמן מבחן לטאטא עם תדירות של 1 Hz ו מנדנוד הטיה של 0.5% ב 100 ° c.
- כדי לקבוע את גמישות והתלות הזמן של הרשת PDMS הסופי, להחיל מבחן לטאטא תדר עם תדירות הנע 0.1-100 Hz ו מנדנוד להטות את המתח של 0.5%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני הוספת TGF-β, מונאולייר של התאים יש הריצוף כמו הצורה והוא ארוז היטב. עם TGF-β הטיפול, תאים הופכים מאורכים יותר מורפולוגיה, הגדלת שטח התא ורכישת פנוטיפ יותר mesenchymal. ניצול מכשיר multi-היטב מפוברק עם אלסטומרים רך PDMS, המאפיינים הפיזיים של תאים בסך הכל 17 תנאים שונים נחקרו. התאים טופלו עם ארבעה שונים TGF-β ריכוזי (0.5, 1, 2, ו 4 ng/mL) וארבע פעמים הדגירה שונים (12, 24, 48, 96 h), ותוצאות אלה מסוכמים באיור 5. התאים שטופלו TGF-β להחיל מדגיש המתיחה גדול יותר אנרגיות המתח מאשר התאים התרבותי ללא TGF-β. תאים מודבטים עם TGF-β עבור 96 h הראו את הגדול ביותר מדגיש המתיחה ואנרגיות המתח. התאים מוחלים מתחים גדולים יותר ומסננים את האנרגיות כאשר הם מטופלים עם ריכוז גבוה יותר של TGF-β. ההבדלים באנרגיות המתח היו ברורים יותר בזמני הדגירה הארוכים יותר.
המשטח של המצע צריך להיות חלק ואחיד מצופה עם ליגנדס, כגון fibronectin או קולגן. משטח שרוט ו/או ציפוי לא אחיד של ליגטים עלול להוביל הקובץ המצורף לתא, וכתוצאה מכך מדידת המתיחה לא מדויקת. איור 6 מראה את המתיחה מקומי מדגיש בשל משטח המצע לא אחיד.
איור 1 : סקירה של ייצור צלחת מרובת היטב. (א) שקופית זכוכית מותאמת אישית היא נקודת ההתחלה. (ב) שקופית הזכוכית מצופה עבה (~ 100 יקרומטר שכבה של pdms). (ג) שכבה של חרוזי נאמנות (המוצג בירוק) הם לאחר מכן ספין מצופים בשכבה עבה של ~ 1 יקרומטר על גבי השכבה הקודמת. (ד) המפריד multi-היטב ממוקם בזהירות על גבי שכבת חרוז הנאמנות. (ה) להשלים את הצלחת multi-היטב מורכב ומוכן לשימוש או אחסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : צ ' אק מותאם אישית עבור ספין-coater. כדי למנוע את הזכוכית התחתונה (שבו PDMS מצופה) מטיסה של צ'אק הסטנדרטי מסתובב, מחזיק מותאם אישית ממוקם על צ'אק. (א) מחזיק מותאם אישית לצ הספין-קואטר. (ב) רישום הנדסי של המחזיק עם כל הממדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : קשיות המצע עם שינוי ריכוז הקרומקשר (wt%). תערובות PDMS מוכנות כמתואר, עם אחוז מקשר נוסף הגדלת מודול אלסטי עד מקסימום של 100 kPa ב 1.8 משקל אחוז (wt%) . מקשר צלב כמדריך, מודולוס כפונקציה של crosslinker קשר מתאים באופן ליניארי, אשר יכול לשמש חוקרים לגבש תערובת שלהם בתוך מודול הרצוי מסוים בטווח זה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : Rheology של PDMS אלסטומר המכיל 0, 0.15, 0.36 ו 1 wt% של סוכני crosslink בטמפרטורה של 100 ° c. סמלי משולש מציינים אובדן (G ' ') וסימנים רבועים מצביעים על מודול האחסון (G '). (א) הזמן לטאטא את התדר של 1 הרץ ולהטות את המתח של 0.5% במהלך הגליה. (ב) בדיקה מנדנוד בתדר של רשת pdms במתח הטיה של 0.5%. (ג) מאמץ לטאטא את רשת pdms בתדירות של 1 Hz. . כל נקודות המידע נרכשו בטרילקאט אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : תוצאות הנציג ניצול מכשיר לחץ המתיחה עם פורמט multi-היטב. מונאולייר של תאים בתנאים שונים היו מתורבתים במתקן רב-היטב כדי למדוד אנרגיה ומאמץ. (A) גרף של המתיחה מדגיש עם הגדלת tgf-β הדגירה זמן עבור tgf-β שונים. המתיחה מדגיש גדל עם הגדלת TGF-β ריכוזי וזמן דגירה. כל הנתונים הם משמעותיים סטטיסטית ביחס לשליטה (כלומר, אין TGF-β) למעט הבאים: 12 h-0.5 ng, 12 h-1 ng, 48 h-1 ng. (ב) גרף של אנרגיה מאמץ עם הגדלת tgf-β הדגירה זמן עבור tgf-β ריכוזים שונים. המתח אנרגיות גדל עם הגדלת TGF-β ריכוזי וזמן דגירה. גודל המדגם נע בין n = 7 ל-n = 15. כל הנתונים הם משמעותיים סטטיסטית ביחס לשליטה (כלומר, אין TGF-β) למעט הבאים: 12 h-0.5 ng, 12 h-1 ng, 24 h-0.5 ng, 24 h-1 ng, 48 h-1 ng. משמעות סטטיסטית נקבע באמצעות מבחן קרוקל ווליס, אשר אינו מניח הפצה נורמלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : תוצאות הנציג מתוך משנה אופטימלית (a, B) וניסוי משביע רצון (C, D). (א) תמונת השתקפות של משטח המצע. מזהמים בלתי רצויים, אשר יכולים לכלול אבק או סיבים, או פגמים חומריים כגון שריטות נמצאים על פני המצע. B להדגיש את מפת הסלולר: בשל המשטח הלא אחיד, מדגיש המתיחה לא סדיר ולא מדויקים הם נצפו סביב האובייקטים. C תמונת השתקפות של משטח המצע. אין מזהמים גלויים לעין. D מפת לחץ של כבלי תא: לא ניתן להבחין בחוסר שיבושים בחפצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ריכוז הקרומקשר (wt%) | סול (פי אי) | סטיית תקן | E (kPa) | סטיית תקן |
| 0 | 0.135 | 0.014 | 0.405 | 0.043 |
| 0.15 | 1 | 0.1 | 3 | 0.35 |
| 0.36 | 4.027 | 0.245 | 12.081 | 0.73 |
| 0.75 | 16.01 | 0.49 | 48.03 | 1.2 |
| 1 | 18.44 | 0.989 | 55.32 | 1.94 |
| 1.5 | 27.638 | 0.93 | 82.91 | 1.64 |
| 1.8 | 33.986 | 0.88 | 101.94 | 1.088 |
| 2 | 33.36 | 0.67 | 100.08 | 1.1 |
טבלה 1: קשיות המצע עם שינוי ריכוז הקרומקשר (wt%). על ידי שינוי ריכוזי מקשר נוספים, מצעים PDMS של מודלי הצעיר הרצוי מפוברק. PDMS להטות מודלי נמדדו באמצעות rheometer ומודלי הצעיר היו נחושים. עבור כל נקודת נתונים, 3 ההכנות בלתי תלויות נעשו וסטיית התקן ניתנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
להצלחת שיטה זו, חיוני לקבל מדגם מצופה אחיד עם עובי קבוע של כ 100 μm. יש לבחור במודולולוס בקפידה כדי לבחון את המשמעות הפיזית של מערכת העניין הביולוגית. בעת בדיית שכבה עליונה, הריכוז של חלקיקי פלורסנט fiducial צריך להיות ממוטב לניתוח מדויק של הזחה וסטרס המתיחה. ניתוח תאים בודדים מבודדים דורש שכבת נאמנות צפופה יותר מאשר מדידת conolאיירס הקונאואני. בנוסף, המשטח של המצע צריך ציפוי יציב ואחיד של מולקולות הדבקה כגון קולגן, fibronectin, ו למינציה כדי להבטיח חיבור תקין של התאים למשטח המצע. יש לנקוט בטיפול מיוחד בעת חיבור המפריד המרובים; זה צריך להיות ממוקם ללא הזזה כדי למנוע איטום PDMS להיות מרוח על פני השטח התרבותי, ואת הקצה החיצוני חייב להיות מיושר בזהירות עם מידות הזכוכית כדי למנוע דליפות על בארות הגבול.
כדי למנוע בארות להיות דולף, כמות נאותה של דבק PDMS צריך להיות מיושם על המחיצה היטב כדי להחזיק אותו במקום. עם זאת, השימוש בכמויות מוגזמות יכסה את משטח התרבות של התאים.
יש להוסיף כמות מספקת של PDMS במהלך הליך ציפוי הטווח. כאשר הריפוי, התנור וארונות התקשורת צריכים להיות ברמה. מספיק PDMS או תנור שאינו מפולס עלול לגרום לעובי PDMS אחיד.
צפיפות חרוז צריך להיות אופטימיזציה עבור ניתוח תקין. כאשר צפיפות חרוז אינו מספיק, ריכוז של חרוזים בנאמנות התערובת PDMS צריך להיות גדל. בנוסף, יש להוסיף כמות נאותה של התערובת לציפוי ספין. כדי להבטיח אותות פלורסנט הנכון של חלקיקים חרוז בנאמנות, מצב ריפוי צריך להיות מפוקח בזהירות. פעמים ארוכות יותר וטמפרטורות גבוהות יותר מאלה שצוינו בפרוטוקול זה עלולות לפגוע בקרינה הפלואורסצנטית. ציפוי חלבון לא תקין על פני המדגם עלול להוביל הדבקה תא עני. כדי למנוע זאת, את פני השטח צריך לנקות את התפוגה של ריאגנטים כגון Sulfo-SANPAH ו ליגניות צריך להיבדק. זמן חשיפה UV כוח צריך להיות אופטימיזציה. Immunofluorescence או בונה חלבון פלורסנט אחרים עשויים להיבדק כדי להבטיח ליגונים מדים ציפוי.
המכשיר המציא עם שיטה זו וקבוצה של ניסוחים PDMS הוא ישים רק כדי מצעים עם מודולים של יאנג החל מ 0.4 kPa כדי 100 kPa. מודלי אחרים עשויים להיות אפשריים באמצעות ניסוחים חלופיים, עם זאת, הטווח הנוכחי משתרע על ערכה גדולה של ערכים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. בעוד שיטה זו מיועדת במיוחד לייצור מרובה היטב, ניתן להשתמש בה גם כדי להכין שקופיות נפרדות או גיאומטריות שקופיות אחרות, ובמקרים אלה ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות משתמש נוסף. בהתגלמות זו, עבה יחסית (1 מ"מ) שקופית זכוכית מועסק, מנעה הצמצם המשותף מספרית גבוהה (NA) מטרות על מיקרוסקופ הפוך. בעוד שמבחינה טכנית ניתן לבנות אלה מנות TFM מרובת היטב באמצעות זכוכית מדלל, שבריאת אלה בעיבוד והרכבה עלול לגרום לקצב גבוה של שבירה, והוא יכול לרוץ בניגוד לגישה תפוקה גבוהה. יתר על כן, ציפוי פני השטח עשוי להיות נחקר יותר עבור יישומים רחבים יותר של המכשיר.
שימוש בפורמט רב-היטב, ניסויים בתפוקה גבוהה אפשריים. בפורמט Multi-היטב אפשרה לנו לבחון את השינויים הפיזיים של תאים NMuMG במהלך חובשים עם TGF-β טיפול עם שילובים של ריכוזים שונים וזמני דגירה שונים במנה אחת. ייצור מכשירי לחץ המתיחה עם הידרוג'לים כגון ג'ל פוליאקרילאמיד יש מספר מגבלות. עם המרכיב הדומיננטי להיות מים, הידרוג'לים רגישים ריכוזי מלח (מאוסמלים), טמפרטורה, לחות, ו-pH שינויים. שינויים בכל אחד ממאפיינים אלה יכולים להוביל לשינוי בתכונות מכניות של החומר, המחייב טיפול נוסף באמצעות דגימות ותוצאות פענוח. יתר על כן, לאחר המים, הידרוג'לים רגישים יותר לזיהומים, הדורשים טיפול נוסף. בניגוד מים הידרוג'לים מבוססי, סיליקון מבוסס PDMS יציב ומלא. לאחר המציא, זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת כל טיפול מיוחד או תנאי אחסון.
הטבע האטום של PDMS מאפשר לנו להמציא מצע מונוליטית, להבטיח כי כל הבארות זהים באמת בעובי המצע והרכב, תוך מתן ביוכימיה ייחודית להיות מיושם במדיה, או תאים שונים כדי להיות מנוצל בכל ובכן. משטח מבוסס הידרוג'ל מאפשר לזיהומים לחלחל ולנוע דרכו, תוך הוספת הידרוג'ל לבארות המחולק למחיצות אחרות כדי למנוע זיהום צולב.
שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד כיצד לחקור את התאים, היבט בסיסי בכל מקום של ביולוגיה התא, באופן התפוקה הגבוהה, המאפשר רכישת נתונים יעילים יותר ומואפשרים. זה עוזר לתרגם את כוח המתיחה מיקרוסקופ לתוך הקרנה כוח הקונקטילה, המאפשר לחוקרים באמת להשתמש בקונקטיטיות כמדד לפעילות התא, או יעילות של תרכובת. כמתודולוגיה, יש לה יישומים נרחבים במדעי הביופיזיקלי ובביו-רפואי, החל מהבנת הפיסיקה של תאים, לאפיון ובדיקת תרכובות פרמצבטיות כנגד סוגי תאים סטנדרטיים, או אולי מיוחדים מאוד תאים בודדים עבור רפואה אישית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ל-AJE ולבית יש עניין בטכנולוגיות הסלולר Live, חברה המחברת חומרים המתוארים במאמר זה.
Acknowledgments
המחברים מודים לטום קוג'ר, מייקל לנדרי, וכריסטופר ג'יי בארט לקבלת סיוע בסינתזה של חרוזים. A.J.E. מכיר מדעי הטבע וההנדסה מענקי מחקר RGPIN/05843-2014 ו אקפקיו/472339-2015, מכונים קנדיים של מחקר הבריאות מענק no 143327, האגודה הקנדית לסרטן מענק no. 703930, והקרן הקנדית לחדשנות .32749 פרויקט רבי קריבנן מכיר במוסדות הבריאות הלאומיים לא. R21HL123522 ו R01HL136209. ח. י. הייתה נתמכת על-ידי כפות הטבע בקוויבק, ובעלי האופי הטבעי של מרכנצ'ה וטכנולוגיות קוויבק. המחברים מודים לג'והנסון על הסיוע בסרטון ובכתב היד ובזישין הוא לסיוע בהכנת הסרטון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. Physical Sciences - Oncology Centers Network. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
