利用标准化定量西方印迹技术, 对跨组织和整个开发过程中的蛋白质水平进行可靠比较
Summary
该方法描述了一种可靠且可重复的方法, 用于使用标准化的定量西方印迹法比较不同组织和不同发育时间点的蛋白质水平。
Abstract
西方印迹是一种通常用于检测和量化蛋白质表达的技术。多年来, 这一技术在基础和临床研究方面都取得了许多进展。然而, 与许多类似的实验技术一样, 西方印迹分析的结果很容易受到在实验设计和执行中做出的选择的影响。特定的家政蛋白传统上被用来使蛋白质水平正常化, 以便进行定量, 但是, 这些蛋白质有许多局限性, 因此在过去几年中受到越来越多的批评。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 我们已经开发, 使我们能够进行复杂的比较蛋白质表达的变化, 在不同的组织, 小鼠模型 (包括疾病模型), 和发育时间点。通过使用荧光总蛋白染色并引入内部加载标准, 可以克服现有的限制, 在实验中可以比较的样本数量, 并系统地比较整个的实验条件范围。这种方法扩大了传统西方印迹技术的使用, 从而使研究人员能够更好地探索不同组织和样本中的蛋白质表达。
Introduction
西方印迹是一种技术, 通常用于检测和量化蛋白质表达, 包括在组织同质或提取物。多年来, 这项技术在基础和临床研究方面都取得了许多进展, 可以作为诊断工具来识别疾病 1、2 的存在。西方印迹最早被描述为1979年将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝化纤维素片的一种方法, 然后使用被放射性标记或与荧光素结合的二级抗体对蛋白质进行可视化或过氧化物酶 3。通过开发商业上可获得的套件和设备, 西方的印迹方法多年来日益标准化和简化。事实上, 这项技术现在很容易由具有不同背景和经验水平的科学家来执行。然而, 与许多类似的实验技术一样, 西方印迹分析的结果很容易受到在实验设计和执行中做出的选择的影响。因此, 重要的是, 标准化的西方印迹方法的可获得性并不掩盖仔细进行实验规划和设计的必要性。实验考虑因素包括但不限于样品制备和处理、蛋白质检测抗体的选择和验证, 以及特别小或大的凝膜转移效率 (lt;10 或 gt;140 kDa)蛋白质4,5,6,7,8,9。原始样品的蛋白质质量在确定随后的西方印迹分析结果方面发挥着重要作用。由于蛋白质可以从各种样品和来源中提取, 包括细胞系、动物模型组织和死后人体组织, 因此需要在处理和处理方面保持一致, 以获得可重现的结果。例如, 当需要长期储存用于蛋白质提取的样品时, 必须认识到, 尽管蛋白质在-80°c 时通常是稳定的, 但在-80°c 时, 提取的蛋白质和完整组织之间的蛋白质稳定性存在差异。报告10。此外, 要获得蛋白质数量的可重复估计, 样品的一致同质化也是至关重要的。在开始大规模定量实验之前, 可能需要优化不同的裂解缓冲液和均质方法 (例如, 与自动化方法相比的手动均质化)。
对蛋白质负荷和定量变异性进行归一化的策略对于获得蛋白质表达的稳健、定量结果至关重要。家务蛋白, 如β-肌动蛋白、α-管蛋白、β-管蛋白和甘油-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH), 传统上被用来使蛋白质水平正常化, 以便进行定量。然而, 为量化目的对特定的家政蛋白进行规范化, 在过去几年中, 11,12受到越来越多的批评。例如, 在不同的发育阶段13、14、同一动物4的组织和不同的疾病条件下, 家养蛋白的表达会发生变化 ,16,17。因此, 使用特定的家政蛋白限制了在不同的时间点和不同的实验条件下对不同组织的蛋白质表达进行更复杂比较的可能性。清洁蛋白的另一种方法是使用总蛋白染色 (TPS) 来标记样本中存在的所有蛋白质。TPS 允许根据总蛋白质负载而不是一个特定蛋白质的水平进行信号归一化, 因此, 无论实验条件、样品类型或发展时间点如何, TPS 信号的定量都应具有可比性和可重现性.总蛋白污渍的例子包括 Ponceau S、无污渍凝胶、Coomassie R-350、Sypro-Ruby、Eppicconone、Amydo Black 和 Cy5 (见第18段审查)。这些方法中的每一种都有具体的优势和局限性, 方法的选择取决于可用的时间和工具以及实验设置4、18。
除了使用 TPS 来纠正膜内负荷和定量变化外, 可能还需要比较不同膜之间的样品, 特别是在进行大规模蛋白质表达分析时。然而, 抗体结合效率和总蛋白质染色强度等因素的变化可能会导致蛋白质样本之间的进一步变化, 并在单独的凝胶和膜上进行分析。因此, 为了在这种情况下进行可靠的量化, 有必要引入进一步的归一化步骤, 以考虑膜间的可变性。这可以通过在每个单独分析的膜上加入一个内部加载标准来实现, 该膜在整个实验中保持不变。该标准可以采取任何蛋白质裂解液的形式, 可以获得足够数量的蛋白质裂解物, 用于实验中包括的所有膜。在这里, 我们使用老鼠大脑裂解液 (从5天的对照小鼠获得), 因为大脑很容易同质化, 所获得的蛋白质裂解液在高浓度中含有大量的蛋白质。通过将内部标准加载到一式三份, 可以直接对单独膜上的样品进行归一化和比较。
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 我们已经开发, 使我们能够进行复杂的比较蛋白质表达的变化, 在不同的组织, 小鼠模型 (包括疾病模型), 和发育时间点19。通过将荧光 TPS 与内部加载标准相结合, 我们能够克服现有的样品数量和实验条件方面的限制, 这些限制可以在单个实验中进行比较。这种方法扩大了传统西方印迹技术的使用, 从而使研究人员能够更好地探索不同组织和样本中的蛋白质表达。
Protocol
Representative Results
Discussion
通过适当的实验设计、控制措施和统计分析, 西方印迹可以用于对不同范围的生物样本内和之间的蛋白质表达进行可靠的定量估计。我们在目前的手稿中描述的协议旨在为希望利用西方印迹对更大、更复杂的样本组进行定量分析的研究人员提供指导, 方法是使用基于荧光的组合检测方法、总蛋白质负荷归一化和内部标准。虽然这里的重点是确定和比较不同的小鼠组织和不同年龄的蛋白质表达, 这种?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. j. n. g. 得到 Wellcome 信托基金的支持 (赠款 106080/z z z)。其他资金由 SMA 信托基金 (SMA UK 财团) 提供;T. H. G. & Y-T。H.)、SMA Europe (t. h. g.、d. d. h. & e. j. n. g.)、爱丁堡大学精密医学 DTP (t. h. g.、l. l. l. & a. m.) 和 Euan MacDonald 汽车神经疾病研究中心 (t. h. g.)。
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
Referências
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