Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken
Summary
Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.
Abstract
Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Specifieke huishouding eiwitten hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering, echter deze hebben een aantal beperkingen en hebben daarom steeds meer bekritiseerd in de afgelopen paar jaar. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints. Met behulp van een fluorescerende totaal eiwit vlek en introductie van het gebruik van een interne standaard wordt geladen, is het mogelijk om de bestaande beperkingen in het aantal monsters die binnen experimenten kunnen worden vergeleken en systematisch vergelijken eiwitniveaus over een waaier van experimentele omstandigheden. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.
Introduction
Westelijke bevlekken is een techniek die wordt gebruikt bij het detecteren en kwantificeren van eiwit expressie, met inbegrip in weefsel homogenates of extracten. Loop der jaren heeft deze techniek geleid tot veel vooruitgang in zowel fundamenteel en klinisch onderzoek, waar het kan worden gebruikt als een diagnostisch hulpprogramma te identificeren van de aanwezigheid van ziekte1,2. Westelijke bevlekken werd het eerst beschreven in 1979 als een methode voor het overbrengen van eiwitten van polyacrylamide gels naar nitrocellulose bladen en vervolgens het visualiseren van eiwitten met behulp van secundaire antilichamen die waren ofwel radioactief gelabelde of geconjugeerd met fluoresceïne of peroxidase3. Door de ontwikkeling van commercieel beschikbare kits en apparatuur, zijn westelijke bevlekkende methoden steeds meer gestandaardiseerd en vereenvoudigd door de jaren heen. Inderdaad, de techniek is gemakkelijk nu uitgevoerd door wetenschappers met uiteenlopende achtergronden en niveaus van ervaring. Echter zoals met vele soortgelijke experimentele technieken, wordt het resultaat van westelijke vlek analyses gemakkelijk beïnvloed door de keuzes in het ontwerp en de uitvoering van het experiment. Het is daarom belangrijk, dat de toegankelijkheid van gestandaardiseerde westelijke bevlekkende methoden niet de behoefte aan zorgvuldige experimentele planning verdoezelen en ontwerp. Experimentele aspecten omvatten, maar zijn niet beperkt tot, monster voorbereiding en behandeling, selectie en validatie van antilichamen voor eiwit detectie en gel-naar-membraan spuitrendement van met name kleine of grote ( 140 kDa) eiwitten4,5,6,7,8,9. Eiwit kwaliteit van het oorspronkelijke monster speelt een belangrijke rol bij de bepaling van het resultaat van de daaropvolgende westelijke vlekkenanalyse. Zoals eiwitten kan worden geëxtraheerd uit een grote verscheidenheid van monsters en bronnen, met inbegrip van weefsels van dierlijke modellen, cellijnen en post mortem menselijke weefsels, is consistentie in afhandeling en verwerking vereist om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Bijvoorbeeld, als de langetermijnopslag van monsters voor eiwit extractie vereist is, is het belangrijk om te beseffen dat, hoewel eiwit over het algemeen stabiel bij-80 ° C is, verschillen in eiwitstabiliteit uitgepakte eiwitten en intact weefsels bij-80 ° C geweest gerapporteerde10. Bovendien, met het oog op een reproduceerbare ramingen van de hoeveelheden eiwit, consistente homogenisering van de monsters is cruciaal. Optimaliseren van verschillende lysis buffers en homogenisering methoden (bijvoorbeeld handmatige homogenisering in vergelijking met geautomatiseerde methoden) kan nodig zijn voordat u begint een grootschalige kwantitatieve experiment.
Normalisatie strategieën om te corrigeren voor eiwit laden en kwantificering variabiliteit zijn essentieel voor het verkrijgen van robuuste, kwantitatieve resultaten van eiwit expressie. Huishouden eiwitten zoals β-actine, α-tubuline, β-tubuline en glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) hebben van oudsher gebruikt om te normaliseren eiwitniveaus voor kwantificering. Echter, normalisatie aan specifieke huishouding eiwitten voor kwantificering doeleinden is steeds meer bekritiseerd over de afgelopen paar jaar11,12. Bijvoorbeeld, kunt de uitdrukking van de huishouding eiwitten wijzigen in verschillende ontwikkelingsstadia13,14, over weefsels van dezelfde dieren4en onder verschillende ziekte voorwaarden4,15 ,16,17. Daarom is het gebruik van specifieke huishouding eiwitten beperkt de mogelijkheden van het maken van meer complexe vergelijkingen tussen eiwit expressie uit verschillende weefsels, op verschillende tijdstippen en onder verschillende experimentele omstandigheden. Een alternatief voor huishouden eiwitten aan besturingselement voor eiwit laden variatie is het gebruik van een totale proteïne vlek (TPS) dat etiketten en visualiseert alle eiwitten aanwezig in een monster. TPS kunt signaal normalisering op basis van de totale proteïne laden in plaats van de niveaus van één specifieke proteïne en dus kwantificering van TPS signaal moet zijn vergelijkbaar en reproduceerbare ongeacht de experimentele conditie, monster type of developmental timepoint . Voorbeelden van totaal eiwit vlekken zijn Ponceau S, vlek-vrij gels Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black en Cy5 (herzien in ref. 18). Elk van deze methoden heeft specifieke voordelen en beperkingen en selectie methode hangt af van de tijd en hulpmiddelen beschikbaar, evenals de experimentele opzet4,18.
Naast het gebruik van een TPS om te corrigeren voor binnen-membraan laden en kwantificering variabiliteit, wellicht te vergelijken tussen verschillende membranen, met name bij het uitvoeren van grootschalige eiwit expressie analyse monsters. Echter kan variabiliteit in factoren zoals antilichamen bindende efficiëntie en totaal eiwit vlek intensiteit leiden tot verdere variabiliteit tussen de eiwitsteekproeven die op aparte gels zijn geanalyseerd en membranen. Voor robuuste kwantificering in deze situatie moet het dan ook om een verdere normalisatie stap om de variabiliteit tussen-membraan te verklaren. Dit kan worden bereikt door een interne laden standaard op elk van de afzonderlijk geanalyseerde membranen die constant wordt gehouden over experimenten. Deze standaard kan de vorm aannemen van een eiwit lysate die in voldoende hoeveelheden worden gebruikt in alle membranen opgenomen in het experiment kan worden verkregen. Hier, gebruiken we een lysate van muis hersenen (verkregen uit 5 dag oud besturingselement muizen), omdat de hersenen is gemakkelijk gehomogeniseerd en de verkregen eiwit lysate bevat een aanzienlijke hoeveelheid eiwit met een hoge concentratie. Laden van een interne standaard in drievoud kunt monsters op aparte membranen worden genormaliseerd en vergeleken rechtstreeks.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol die we hebben ontwikkeld zodat ons ertoe complexe vergelijkingen van eiwit expressie variatie in verschillende weefsels, Muismodellen (inclusief ziekte modellen) en ontwikkelingsstoornissen timepoints19. Door een fluorescerende TPS te combineren met het gebruik van een interne laden standaard, konden we bestaande beperkingen in het aantal monsters en experimentele omstandigheden die binnen een enkele experiment kunnen worden vergeleken. Deze aanpak breidt het gebruik van traditionele westelijke vlek technieken, waardoor onderzoekers beter verkennen eiwituitdrukking in verschillende weefsels en monsters.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de juiste proefopzet, de controlemaatregelen en de statistische analyse, kan westelijke bevlekken worden gebruikt om betrouwbare kwantitatieve ramingen van eiwit expressie binnen en tussen een gevarieerd aanbod van biologische monsters. Het protocol we in het huidige manuscript beschrijven wil dienen als richtsnoer voor onderzoekers op zoek naar het westelijke bevlekken om kwantitatieve analyse over grotere en complexere groepen van monsters, met behulp van een combinatie van fluorescentie gebaseerde gebruiken detect…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.J.N.G. wordt ondersteund door de Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Andere financiering is verstrekt door de SMA Trust (SMA UK Consortium; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), de Universiteit van Edinburgh DTP in precisie geneeskunde (T.H.G., L.L. & A.M.M.) en het Euan MacDonald-centrum voor Motor Neurone Disease Research (T.H.G).
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
Referências
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. . Applied longitudinal analysis. , (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
